En optimeret protokol for elektroforetisk mobilitet Shift Assay brug af infrarød fluorescerende farvestof-mærkede oligonukleotider
Summary
Vi beskriver her en optimeret protokol af fluorescerende elektroforetisk mobilitet Shift Analyser (FEMSA) ved hjælp af oprensede SOX-2 proteiner sammen med infrarøde fluorescerende farvestof-mærkede DNA-prober som en case til at tackle en vigtig biologisk spørgsmål.
Abstract
Elektroforetisk mobilitet ændring-assays (EMSA) er en instrumental værktøj til at karakterisere de interaktioner mellem proteiner og deres mål-DNA-sekvenser. Radioaktivitet har været den fremherskende metode til DNA-mærkning i EMSAs. Men de seneste fremskridt inden for fluorescerende farvestoffer og scanningsmetoder bedt brugen af fluorescerende tagging af DNA som et alternativ til radioaktivitet for fordelene ved nem håndtering, hvilket sparer tid, reducere omkostningerne og forbedre sikkerheden. Vi har for nylig brugt fluorescerende EMSA (FEMSA) til succes løse en vigtig biologisk spørgsmål. Vores Femsa analyse giver mekanistisk indsigt i virkningen af en missense-mutation, G73E, i stærkt konserverede HMG transkriptionsfaktor SOX-2 på olfaktoriske neuron typen diversificering. Vi fandt, at mutante SOX-2 G73E protein ændrer specifik DNA bindingsaktivitet, hvorved olfaktoriske transformation neuron identitet. Her præsenterer vi en optimeret og omkostningseffektiv trin-for-trin-protokolfor FEMSA bruger infrarød fluorescerende farvestof-mærkede oligonukleotider indeholder LIM-4 / SOX-2 tilstødende target sites og oprensede SOX-2-proteiner (WT og mutant SOX-2 G73E proteiner) som et biologisk eksempel.
Introduction
EMSAs bruges til at analysere interaktioner mellem DNA og proteiner ved hjælp af nativ polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) for at løse en blanding af et protein af interesse og et mærket DNA probe, der indeholder potentielle målsteder af proteinet 1. En DNA-probe bundet med protein migrerer langsommere sammenlignet med en fri DNA-probe, og er derfor forsinket i sin vandring gennem en polyacrylamidmatrix. Radiomærkning af DNA ved 32 P har været den fremherskende metode til påvisning i EMSAs. Selvom anvendelsen af radioaktiv mærkning i biokemisk forskning har været gavnlig, er metoder til alternativ DNA-mærkning med sammenlignelig følsomhed er ansat på grund af de sikkerheds- og sundhedsmæssige risici forbundet med håndtering af radioaktivitet. Disse alternative fremgangsmåder indbefatter konjugering af DNA med biotin 2 eller digoxigenin (DIG) 3 (begge er derefter detekteret ved kemiluminescens systemer), SYBR green farvning af PAGE-geler 4,eller direkte påvisning af DNA-fluorescerende farvestof-konjugater ved at scanne gelen 5,6.
De opløste geler af EMSAs bruger radioaktivt mærkede DNA-prober kræver postrun behandling gennem autoradiografi film eller et phosphorimager system til at detektere radioaktive signaler 1,7. Geler af EMSAs under anvendelse af biotin- 2 eller DIG-konjugerede 3 DNA-prober skal også behandles og overføres til en egnet membran og derefter detekteret ved kemiluminescens 6. SYBR green farvning af gelen kræver postrun gelfarvning og en fluorescerende scanner 4. Da der kræves postrun gel procestrin for EMSAs bruger disse DNA-teknikker mærkning, kan det løses gel analyseres én gang. I modsætning hertil kan DNA-prober mærket med fluoroforer detekteres direkte i gelen inde glaspladerne af en scanner. Derfor kan DNA-protein-interaktioner overvåges og analyseres flere gange på forskellige tidspunkter under kørslen, hvilketreducerer tid og omkostninger betydeligt. De DNA-fluorescerende farvestof konjugater, der har været anvendt til EMSAs indbefatter Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluorescein 9, og infrarøde fluorescerende farvestoffer 4-6.
Transkriptionel regulering kræver protein-DNA interaktioner af transkriptionsfaktorer og deres målgener. Koordinering af disse interaktioner genererer forskellige celletyper fra en fælles stamfader under dyr udvikling. En neutral frem genetisk skærm identificeret en missense-mutation, G73E, i stærkt konserverede HMG DNA-bindende domæne af Caenorhabditis elegans transkriptionsfaktor SOX-2. De mutationen resulterer i en celle identitet transformation af AWB olfaktoriske neuroner i AWC olfaktoriske neuroner på molekylære, morfologiske og funktionelle niveauer 5,10. SOX-2 differentielt regulerer terminal differentiering af AWB og AWC neuroner ved at interagere med kontekstafhængige partner transkriptionsfaktorer og respektiveDNA målsteder 5,10. SOX-2 partnere med LIM-4 (LHX) i klemme AWB neuronal differentiering, mens SOX-2 partnere med CEH-36 (OTX / OTD) i terminal AWC neuronal differentiering. Luciferasereporteren analyser viser, at SOX-2 og mutant SOX-2 G73E proteiner har kooperative interaktioner med transkriptionelle cofaktorer LIM-4 og CEH-36 for at aktivere en promotor udtrykt i AWB og AWC neuroner. Imidlertid SOX-2 og mutant SOX-2 G73E vises forskellen aktiveringsegenskaber af promotoren. For at undersøge den molekylære basis for differential DNA-bindende aktiviteter SOX-2 og SOX-2 G73E, blev fEMSAs udført med disse proteiner og deres potentielle målsteder.
Først blev en bioinformatik tilgang til at identificere det biologisk relevante DNA-bindende sekvenser inden for 1 kb promotorområde anvendt i luciferase assay. Da flere potentielle SOX-2 bindingssteder var til stede under hele promotor, vi fokuseredepå forudsagte SOX-2 bindingssteder støder op til putativ CEH-36 eller LIM-4 bindingssteder og evolutionært konserveret mellem forskellige nematodearter. Disse sekvenser blev slettet eller muteret, og efterfølgende testet in vivo for deres aktivitet til at udtrykke GFP reporter transgener i AWB eller AWC neuroner. Gennem denne fremgangsmåde identificerede vi potentielle LIM-4 / SOX-2 og CEH-36 / SOX-2 tilstødende målsteder, som er specifikt nødvendige for ekspression af GFP i AWB og AWC neuroner, henholdsvis 5. Vi undersøgte de potentielle forskelle i DNA-binding af SOX-2 og SOX-2 G73E hjælp Femsa med de identificerede LIM-4 / SOX-2 og CEH-36 / SOX-2 tilstødende målsteder. Vores EMSA analyse viste, at SOX-2 G73E ikke binde DNA-proben indeholder LIM-4 / SOX-2 tilstødende målsteder (kræves for genekspression i AWB) så effektivt som WT SOX-2 gjorde. Dog SOX-2 og SOX-2 G73E havde ingen forskel i binding af DNA-proben indeholdende det CEH-36 / SOX-2 adjacent målsted (kræves til genekspression i AWC) 5,10. Vores Femsa analyser give mekanistisk indsigt i beskaffenheden af SOX-2 G73E-mutationen i at påvirke specifikke DNA-bindingsaktivitet for AWB-til-AWC celleidentitet transformation fænotype. Her beskriver vi en optimeret protokol FEMSA anvendelse af oprensede 6xHis-SOX-2 eller 6xHis-SOX-2 G73E sammen med infrarød fluorescerende farvestof-mærkede DNA-prober indeholdende LIM-4 / SOX-2 tilstødende målsteder som case til at tackle en vigtig biologisk spørgsmål.
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs er et effektivt værktøj til at undersøge protein-DNA interaktioner, og er et alternativ til radioaktiv mærkning af DNA. Fluorescerende farvestoffer, såsom infrarøde farvestoffer er kommercielt tilgængelige, og giver en mere sikker og miljøvenlig metode sammenlignet med radioaktivt DNA-mærkning. EMSAs med infrarøde stråler fluorescerende farvestof-mærkede oligonukleotider kræver ikke postrun gel behandlingstrin, og derfor spare tid og omkostninger i forhold til andre DNA-mærkning teknikker. Tiden til…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
Referências
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
