Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden
Summary
We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van TL-elektroforetische mobiliteit shift assays (Femsa) met behulp van gezuiverd SOX-2 eiwitten in combinatie met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes als een case study van een belangrijke biologische kwestie aan te pakken.
Abstract
Elektroforetische mobiliteit (EMSA) zijn instrumenteel middel om de interacties tussen eiwitten en hun doel DNA-sequenties te karakteriseren. Radioactiviteit de meest gangbare DNA labeling in EMSA's geweest. Echter, recente vorderingen in fluorescente kleurstoffen en scanmethodes het gebruik van fluorescerende tagging van DNA als alternatief voor radioactiviteit de voordelen van eenvoudige bediening gevraagd, bespaart tijd, lagere kosten en betere veiligheid. We hebben recent gebruikte fluorescerende EMSA (FEMSA) om met succes een belangrijke biologische vraag. Onze FEMSA analyse geeft mechanistisch inzicht in het effect van een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG transcriptiefactor SOX-2 op olfactorische soort neuron diversificatie. We vonden dat mutant SOX-2 G73E eiwit verandert specifieke DNA-bindende activiteit, waardoor olfactorische neuron identiteit transformatie veroorzaken. Hier presenteren we een optimale en kosteneffectieve stap-voor-stap protocolvoor FEMSA met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen en gezuiverd SOX-2 eiwitten (WT en mutant SOX-2 G73E eiwitten) als biologisch voorbeeld.
Introduction
EMSA's worden gebruikt om de interacties tussen DNA en eiwitten geanalyseerd door natieve polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) een mengsel van een eiwit van interesse en een gemerkte DNA-probe die potentiële doelplaatsen van het eiwit 1 te lossen. Een DNA probe gebonden met proteïne migreert langzamer vergeleken met een vrij DNA probe, en derhalve vertraagd in zijn migratie door een polyacrylamide-matrix. Radioactief merken van DNA door 32 P is de belangrijkste methode voor de detectie in EMSA's geweest. Hoewel de toepassing van radioactief merken in biochemisch onderzoek gunstig is geweest, zijn de methoden van alternatieve DNA labeling met vergelijkbare gevoeligheid wordt ingezet als gevolg van de gezondheids- en veiligheidsrisico's in verband met de behandeling van radioactiviteit. Deze alternatieve werkwijzen omvatten conjugatie van biotine DNA met 2 of digoxigenine (DIG) 3 (beide worden vervolgens gedetecteerd door chemiluminescentie systemen), SYBR groen kleuring van de gels PAGE 4,of directe detectie van DNA-fluorescente kleurstof conjugaten door het scannen van de gel 5,6.
De opgeloste gels EMSA's gebruikt radioactief gemerkte DNA-probes vereisen postrun verwerking, autoradiografie films of fosforimager systeem radioactieve signalen 1,7 detecteren. Gels EMSA gebruik biotine- 2 of DIG-geconjugeerd 3 DNA probes moeten worden verwerkt en overgebracht op een geschikt membraan en gedetecteerd door chemiluminescentie 6. SYBR groene kleuring van de gel vereist postrun gel kleuring en fluorescentie scanner 4. Aangezien postrun gel bewerkingsstappen zijn vereist voor EMSA's met behulp van deze DNA-labeling-technieken, kunnen de omgezette gel slechts eenmaal getest. Daarentegen kunnen DNA-probes gelabeld met fluoroforen direct worden gedetecteerd in de gel in de glasplaten met een scanner. Daarom kan de DNA-eiwit interacties worden gevolgd en meerdere malen op verschillende tijdstippen getest tijdens de vlucht, dievermindert de tijd en kosten. De DNA-fluorescerende kleurstof conjugaten die zijn gebruikt voor EMSA's omvatten Cy3 6,8, 6,8 Cy5, fluoresceïne 9 en infrarood fluorescerende kleurstoffen 4-6.
Gentranscriptieregulatie vereist eiwit-DNA interacties van transcriptiefactoren en hun target genen. De coördinatie van deze interacties genereert diverse celtypen vanuit een gemeenschappelijke voorouder tijdens de ontwikkeling van dieren. Een onpartijdige forward genetische screen identificeerde een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG DNA-bindende domein van de Caenorhabditis elegans transcriptiefactor SOX-2. De mutatie resulteert in een cel identiteit transformatie van AWB olfactorische neuronen in AWC olfactorische neuronen op moleculair, morfologische en functionele niveaus 5,10. SOX-2 regelt differentieel de terminal differentiatie van AWB en AWC neuronen door interactie met context-afhankelijke partner transcriptiefactoren en de respectieveDNA doelplaatsen 5,10. SOX-2 partners met LIM-4 (LHX) in terminal AWB neuronale differentiatie, terwijl de SOX-2 partners met CEH-36 (OTX / OTD) in terminal AWC neuronale differentiatie. Luciferase reporter assays tonen aan dat SOX-2 en mutant SOX-2 G73E eiwitten coöperatieve interacties met cofactoren transcriptionele LIM-4 en CEH-36 een promoter uitgedrukt in AWB en AWC neuronen activeren. Echter, SOX-2 en mutant SOX-2 G73E weergegeven differentiële activering eigenschappen van de promotor. Om de moleculaire basis van differentiële DNA bindingsactiviteiten van SOX-2 en SOX-2 G73E te onderzoeken werden uitgevoerd fEMSAs met deze eiwitten en de potentiële doelplaatsen.
Eerst werd een bioinformatica aanpak om de biologisch relevante DNA bindende sequenties in het promotorgebied 1 kb gebruikt in de luciferase assay identificeren. Sinds meerdere potentiële SOX-2 bindende locaties in de promotor aanwezig waren, hebben we ons gerichton voorspelde SOX-2 bindingsplaatsen naast vermeende CEH-36 of LIM-4-bindende plaatsen en evolutionair geconserveerd tussen verschillende soorten aaltjes. Deze sequenties werden gedeleteerd of gemuteerd, en vervolgens in vivo getest op hun activiteit GFP reporter transgenen in AWB of AWC neuronen tot expressie. Door deze benadering identificeerden we potentiële LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen die specifiek zijn voor de expressie van GFP in AWB en AWC neuronen respectievelijk 5 vereist. We onderzochten de mogelijke verschillen in de DNA-binding van SOX-2 en SOX-2 G73E behulp van Femsa met de geïdentificeerde LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelwit sites. Onze analyse toonde aan dat EMSA SOX-2 G73E de DNA-probe die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen (vereist voor genexpressie in AWB) niet zo efficiënt WT SOX-2 deed niet binden. Echter, SOX-2 en SOX-2 G73E had geen verschil in het binden van de DNA-probe die het CEH-36 / SOX-2 adjacent target site (die nodig zijn voor genexpressie in AWC) 5,10. Onze analyses geven FEMSA mechanistisch inzicht in de aard van de SOX-2 G73E-mutatie in zowel het gebruik van DNA-bindingsactiviteit van de AWB naar AWC celidentiteit transformatiefenotype. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol van FEMSA met gezuiverd 6xHis-SOX-2 of 6xHis-SOX-2 G73E samen met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes met de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen als een case study aan te pakken een belangrijke biologische vraag.
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs zijn een efficiënt instrument om eiwit-DNA interacties te onderzoeken, en zijn een alternatief voor radioactieve labeling van DNA. Fluorescerende kleurstoffen zoals infrarood kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar, en een veiligere en milieuvriendelijkere manier dan radioactieve DNA labeling. EMSA's met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden vereisen geen postrun gel processtappen, en dus tijd en kosten te besparen in vergelijking met andere DNA-labeltechnieken. De tijd t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
Referências
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
