Electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट रंजक लेबल oligonucleotides उपयोग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल
Summary
हम यहाँ फ्लोरोसेंट electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट assays (FEMSA) शुद्ध SOX -2 प्रोटीन एक साथ उपयोग कर एक मामले का अध्ययन एक महत्वपूर्ण जैविक सवाल से निपटने के लिए के रूप में अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल डीएनए जांच के साथ की एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन।
Abstract
Electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट assays (EMSA) प्रोटीन और उनके लक्ष्य डीएनए दृश्यों के बीच बातचीत को चिह्नित करने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई उपकरण हैं। रेडियोधर्मिता EMSAs में डीएनए लेबलिंग की प्रमुख विधि से किया गया है। हालांकि, फ्लोरोसेंट रंगों और स्कैनिंग तरीकों में हाल के अग्रिमों आसान से निपटने के फायदे के लिए रेडियोधर्मिता के लिए एक विकल्प के रूप में डीएनए के फ्लोरोसेंट टैगिंग के उपयोग के लिए प्रेरित किया है, समय की बचत लागत को कम करने, और सुरक्षा में सुधार। हमने हाल ही में फ्लोरोसेंट EMSA (FEMSA) का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक एक महत्वपूर्ण जैविक सवाल का पता करने के लिए। हमारे FEMSA विश्लेषण अत्यधिक संरक्षित एचएमजी प्रतिलेखन कारक SOX -2 घ्राण न्यूरॉन प्रकार के विविधीकरण पर, एक missense उत्परिवर्तन, G73E के प्रभाव में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हमने पाया है कि उत्परिवर्ती SOX -2 G73E प्रोटीन विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी गतिविधि बदल, जिससे घ्राण न्यूरॉन पहचान परिवर्तन के कारण। यहाँ, हम उपस्थित एक अनुकूलित और लागत प्रभावी कदम-दर-कदम प्रोटोकॉलFEMSA अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल लिम-4 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों और शुद्ध SOX -2 प्रोटीन (WT और उत्परिवर्ती SOX -2 G73E प्रोटीन) एक जैविक उदाहरण के रूप में युक्त ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स प्रयोग करने के लिए।
Introduction
EMSAs ब्याज की एक प्रोटीन और एक लेबल डीएनए प्रोटीन 1 के संभावित लक्ष्य साइटों युक्त जांच का एक मिश्रण को हल करने के लिए देशी जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) का उपयोग करके डीएनए और प्रोटीन के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। प्रोटीन के साथ ही एक डीएनए जांच धीमी एक मुक्त डीएनए जांच के साथ तुलना में विस्थापित हो जाएगा, और इसलिए एक polyacrylamide मैट्रिक्स के माध्यम से अपने प्रवास में मंद है। 32 पी द्वारा डीएनए के radiolabeling EMSAs में पता लगाने के लिए प्रमुख विधि से किया गया है। हालांकि जैव रासायनिक अनुसंधान में radiolabeling के आवेदन फायदेमंद रहा है, तुलनीय संवेदनशीलता के साथ वैकल्पिक डीएनए लेबलिंग के तरीकों रेडियोधर्मिता से निपटने के साथ जुड़े स्वास्थ्य और सुरक्षा जोखिम के कारण नियोजित किया जा रहा है। इन वैकल्पिक तरीकों, बायोटिन 2 या digoxigenin (डीआईजी) 3 (जो दोनों के तो chemiluminescent सिस्टम द्वारा पता लगाया जाता है) के साथ डीएनए के विकार पृष्ठ जैल 4 की SYBR हरी धुंधला शामिलया जेल 5,6 स्कैनिंग द्वारा डीएनए फ्लोरोसेंट रंजक conjugates के प्रत्यक्ष पता लगाने।
Radioactively लेबल डीएनए जांच का उपयोग EMSAs का संकल्प लिया जैल autoradiography फिल्मों के माध्यम से postrun प्रसंस्करण या रेडियोधर्मी संकेत 1,7 पता लगाने के लिए एक phosphorimager प्रणाली की आवश्यकता है। Biotin- 2 या डीआईजी संयुग्मित 3 डीएनए जांच का उपयोग EMSAs की जैल भी संसाधित किया जाना चाहिए और एक उपयुक्त झिल्ली पर स्थानांतरित किया और फिर chemiluminescence 6 से पता चला। जेल के SYBR हरी धुंधला postrun जेल धुंधला हो जाना और एक फ्लोरोसेंट स्कैनर 4 की आवश्यकता है। चूंकि postrun जेल प्रसंस्करण कदम इन डीएनए लेबलिंग तकनीक का उपयोग कर EMSAs के लिए आवश्यक हैं, हल जेल केवल एक बार यत्न किया जा सकता है। इसके विपरीत, डीएनए fluorophores के साथ लेबल जांच सीधे एक स्कैनर द्वारा गिलास प्लेट के अंदर जेल में पता लगाया जा सकता है। इसलिए, डीएनए, प्रोटीन बातचीत पर नजर रखी जा सकता है और चलाने के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर कई बार यत्न जोकाफी समय और लागत कम कर देता है। डीएनए फ्लोरोसेंट रंजक conjugates कि EMSAs के लिए इस्तेमाल किया गया है Cy3 6.8, 6.8 Cy5, fluorescein 9, और अवरक्त फ्लोरोसेंट रंगों 4-6 शामिल हैं।
Transcriptional विनियमन प्रतिलेखन कारक है और अपने लक्ष्य जीन के प्रोटीन डीएनए बातचीत की आवश्यकता है। इन मुलाकातों के समन्वय पशु विकास के दौरान एक आम पूर्वज से विविध प्रकार की कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। एक निष्पक्ष आगे आनुवंशिक स्क्रीन, एक missense उत्परिवर्तन, G73E पहचान अत्यधिक संरक्षित Caenorhabditis एलिगेंस प्रतिलेखन कारक SOX -2 के एचएमजी डीएनए बाध्यकारी डोमेन। आणविक रूपात्मक, और कार्यात्मक स्तरों पर 5,10 AWB आंगनवाडी घ्राण न्यूरॉन्स में घ्राण न्यूरॉन्स की एक सेल पहचान परिवर्तन में उत्परिवर्तन का परिणाम है। SOX -2 विभिन्न संदर्भ पर निर्भर साथी प्रतिलेखन कारक और संबंधित के साथ बातचीत से AWB और आंगनवाडी न्यूरॉन्स के टर्मिनल भेदभाव को नियंत्रित करता हैडीएनए लक्ष्य साइटों 5,10। SOX -2 टर्मिनल AWB neuronal भेदभाव में लिम-4 (LHX) के साथ भागीदारों, SOX -2 टर्मिनल आंगनवाडी neuronal भेदभाव में CEH-36 (OTX / OTD) के साथ भागीदार। Luciferase संवाददाता assays दिखाने जबकि उस SOX-2 और उत्परिवर्ती SOX -2 G73E प्रोटीन ट्रांसक्रिप्शनल सहकारकों लिम-4 और CEH-36 के साथ सहकारी बातचीत एक प्रमोटर AWB और आंगनवाडी न्यूरॉन्स में व्यक्त सक्रिय करने के लिए है। हालांकि, SOX-2 और उत्परिवर्ती SOX -2 G73E प्रमोटर के अंतर सक्रियण गुण का प्रदर्शन किया। SOX -2 और SOX -2 G73E का अंतर डीएनए बाध्यकारी गतिविधियों के आणविक आधार की जांच करने के लिए, fEMSAs इन प्रोटीन और उनके संभावित लक्ष्य साइटों के साथ प्रदर्शन किया गया।
सबसे पहले, एक जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण जैविक रूप से प्रासंगिक डीएनए 1 केबी प्रमोटर luciferase परख में इस्तेमाल किया क्षेत्र के भीतर दृश्यों बाध्यकारी की पहचान करने के लिए लिया गया था। के बाद से कई संभावित SOX -2 बाध्यकारी साइटों प्रमोटर भर में मौजूद थे, हम ध्यान केंद्रितभविष्यवाणी की SOX -2 बाध्यकारी ख्यात CEH-36 या लिम-4 बाध्यकारी साइटों से सटे और evolutionarily विभिन्न प्रजातियों के बीच निमेटोड संरक्षित साइटों पर। इन दृश्यों को हटा दिया गया है या उत्परिवर्तित, और बाद में उनकी गतिविधियों AWB या आंगनवाडी न्यूरॉन्स में GFP संवाददाता transgenes व्यक्त करने के लिए vivo में परीक्षण किया। इस दृष्टिकोण के माध्यम से, हम संभावित लिम-4 / SOX -2 और CEH-36 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों है कि विशेष रूप से AWB और आंगनवाडी न्यूरॉन्स में क्रमश: 5 में GFP की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक हैं की पहचान की। हम SOX -2 और SOX -2 G73E पहचान लिम-4 / SOX -2 और CEH-36 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों के साथ FEMSA का उपयोग कर के बंधन डीएनए में संभावित मतभेद की जांच की। हमारे EMSA विश्लेषण से पता चला है कि sox -2 G73E डीएनए लिम-4 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों (AWB में जीन की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक) युक्त जांच के लिए बाध्य नहीं किया था के रूप में कुशलता के रूप में गुम्मट SOX -2 किया था। हालांकि, SOX -2 और SOX -2 G73E डीएनए युक्त जांच बाध्यकारी में कोई अंतर नहीं था CEH-36 / SOX -2 एकdjacent लक्ष्य साइट 5,10 (आंगनवाडी में जीन की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक)। हमारे FEMSA AWB करने वाली आंगनवाडी सेल पहचान परिवर्तन phenotype के लिए विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी गतिविधि को प्रभावित करने में SOX -2 G73E उत्परिवर्तन की प्रकृति में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान विश्लेषण करती है। यहाँ, हम शुद्ध 6xHis-SOX -2 या 6xHis-SOX -2 G73E अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल डीएनए एक मामले का अध्ययन से निपटने के लिए के रूप में लिम-4 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों युक्त जांच के साथ एक साथ प्रयोग FEMSA के एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन एक महत्वपूर्ण जैविक सवाल।
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs प्रोटीन डीएनए बातचीत की जांच के लिए एक कुशल उपकरण हैं, और डीएनए के रेडियोधर्मी लेबलिंग के लिए एक विकल्प हैं। ऐसे अवरक्त रंजक के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और रेडियोधर्मी …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
Referências
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