Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol
Summary
Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.
Abstract
Elektroforetik hareket kayma deneyleri (EMSA) proteinler ve hedef DNA dizileri arasındaki etkileşimi karakterize eden bir aracı bir araçtır. Radyoaktivite EMSA DNA etiketleme baskın yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar ve tarama yöntemleri son gelişmeler, zaman tasarrufu maliyetini azaltarak ve güvenliğini geliştirmek, kolay kullanım avantajları için radyoaktivite alternatif olarak DNA floresan etiketleme kullanımı teşvik etmiştir. Biz son zamanlarda başarıyla önemli bir biyolojik soruyu ele almak için floresan EMSA (FEMSA) kullandık. Bizim FEMSA analizi yüksek derecede korunmuş HMG transkripsiyon faktörü SOX-2 koku nöron tipi çeşitlendirilmesi üzerinde, bir missense mutasyon, G73E yürürlüğe mekanik görmemizi sağlar. Mutantını SOX-2 G73E proteini ve böylece koku nöron kimlik dönüşümü neden spesifik DNA bağlanma aktivitesi değiştirir bulundu. Burada, mevcut olan bir iyileştirilmiş ve adım adım protokolü maliyetliFEMSA biyolojik örnek olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ve saflaştırılmış SOX-2 proteinleri (WT ve mutant SOX-2 G73E proteinler) içeren kızıl ötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak.
Introduction
EMSA ilgi konusu bir protein ve protein 1 potansiyel hedef sitesi ihtiva eden bir işaretli DNA sondası bir karışımını çözmek için yerel poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanılarak DNA ve protein arasındaki etkileşimi analiz etmek için kullanılır. protein ile bağlı bir DNA probu yavaş serbest DNA probu ile karşılaştırılır ve bir poliakrilamit matris boyunca, geçiş nedenle geciktirilir değiştirecektir. 32 P DNA Radyo-etiketlenmesi EMSA tespiti için baskın bir yöntem olmuştur. biyokimyasal araştırmalarda radyo sınıflandırılmasıyla uygulama yararlı olmasına rağmen, benzer hassasiyetle alternatif DNA etiketleme yöntemleri nedeniyle radyoaktivite taşıma ile ilgili sağlık ve güvenlik risklerine istihdam edilmektedir. Bu alternatif yöntemler, biyotin 2 veya digoksijenin (DIG) 3 (her ikisi de daha sonra kimyasal olarak ışık veren sistemler tarafından tespit edilir) olan DNA konjügasyon PAGE jelleri 4 SYBR yeşil boyama dahilya da jel 5,6 tarayarak DNA floresan boya konjügatlarının doğrudan tespiti.
Radyoaktif olarak etiketlenmiş DNA sondaları kullanılarak EMSA çözülmesi jeller postrun otoradyografi filmler içinden işleme veya radyoaktif sinyaller 1,7 tespit etmek için, bir Phosphorimager sistemi gerektirmektedir. Biotin-2 veya DIG-konjuge 3 DNA sondaları kullanılarak EMSA ve jeller de işlenebilir ve uygun bir membran üzerine aktarıldı ve kemiluminesans 6 tarafından tespit edilmelidir. Jelin SYBR yeşil boyama postrun jel boyama ve floresan tarayıcı 4 gerektirir. postrun jel işlem adımları, bu DNA etiketleme teknikleri kullanılarak EMSA için gerekli olması nedeniyle, giderilmiş jel bir kez analiz edilebilir. Bunun aksine, floroforlar ile etiketlenmiş DNA probları Bir tarayıcıdan cam plakalar içindeki jelde tespit edilebilir. Böylece, DNA-protein etkileşimleri izlenebilir ve çalışma sırasında farklı zaman noktalarında birkaç kez deneye tabi olanönemli ölçüde zaman ve maliyeti azaltır. EMSA kullanılmaktadır DNA fluoresan boya konjügatları Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluoresein 9 ve kızıl ötesi floresan boyalar 4-6 içerir.
Transkripsiyonal düzenleme transkripsiyon faktörleri ve hedef genlerin protein-DNA etkileşim gerektirir. Bu etkileşimlerin Koordinasyon hayvan gelişimi sırasında ortak bir progenitör gelen farklı hücre tipleri oluşturur. Tarafsız bir ileri genetik ekranı Caenorhabditis elegans transkripsiyon faktörü SOX-2 yüksek derecede korunmuş HMG DNA-bağlama etki, yanlış anlamlı bir mutasyon, G73E tespit edilmiştir. , Moleküler morfolojik ve fonksiyonel düzeyde 5,10 at AWC koku nöronlar içine AWB koku nöronların hücre kimliği dönüşümünde mutasyon sonuçları. SOX-2 farklı şekilde bağlam-bağımlı ortak transkripsiyon faktörlerinin ve ilgili etkileşerek AWB ve AWC nöronların terminal farklılaşmasını düzenleyenDNA hedef site 5,10. SOX-2 terminali AWB nöronal farklılaşma LIM-4 (LHX) işbirliği, SOX-2 terminali AWC nöron farklılaşma CEH-36 (OTX / OTD) ile işbirliği yapmaktadır. Lusiferaz raportör testleri gösterirken bu SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E proteinleri AWB ve AWC nöronlarda ifade edilen bir promotör etkinleştirmek için transkripsiyonel kofaktörler LIM-4 ve CEH-36 ile işbirliği etkileşimleri vardır. Bununla birlikte, SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E promoteri ayırıcı etkinleştirme özelliklerine gösterilir. SOX-2 ve SOX-2 G73E ayırıcı bir DNA bağlama aktivitesi moleküler temelini araştırmak için, fEMSAs bu proteinlerin ve olası hedef alanlan ile yapıldı.
İlk olarak, biyoenformatik yaklaşımı lusiferaz tahlilde kullanılan 1 kb promoter bölgesi içinde bağlama dizileri biyolojik ilgili DNA tespit alındı. Birden fazla potansiyel SOX-2 bağlayıcı siteler promotör boyunca mevcut olduğundan, biz odaklıfarazi CEH-36 ya da LIM-4 bağlanma yerleri bitişik ve evrimsel çeşitli nematod türlerinin arasında korunan tahmin SOX-2 bağlayıcı sitelerde. Bu diziler, silinmiş ya da mutasyona uğramış, ve daha sonra AWB veya AWC nöronlarda GFP raportör transgenleri ifade etme aktivitesi için in vivo olarak test edilmiştir. Bu yaklaşım sayesinde, özellikle AWB ve AWC nöronlar, sırasıyla, 5 GFP ekspresyonu için gerekli olan LIM-4 / SOX-2 potansiyeli ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef sitesi belirlenmiştir. Biz SOX-2 ve SOX-2 LIM-4 / SOX-2 tespit ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef siteleri ile FEMSA kullanarak G73E bağlayıcı DNA potansiyel farklılıkları araştırıldı. Bizim EMSA analizi SOX-2 G73E kadar etkin WT SOX-2 gibi (AWB gen ifadesi için gerekli olan) LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ihtiva eden DNA probu bağlamak olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, SOX-2 ve SOX-2 G73E içeren DNA probu bağlama fark vardı CEH-36 / SOX-25,10 (AWC gen ifadesi için gerekli olan) djacent hedef bölge. Bizim FEMSA AWB-to-AWC hücre kimlik dönüşümü fenotip için spesifik DNA bağlama aktivitesini etkileyen SOX-2 G73E mutasyonunun doğaya mekanik bilgiler sağlayabilir analiz eder. Burada, saflaştırılmış 6xHis-SOX-2 veya 6xHis-SOX-2 çözmek için bir vaka çalışması olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef siteleri içeren kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte G73E kullanarak FEMSA optimize edilmiş bir protokol tarif önemli bir biyolojik bir soru.
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır ve DNA radyoaktif etiketleme bir alternatiftir. kızıl ötesi boyalar gibi floresan boyalar ticari olarak temin edilebilir, ve radyoaktif bir DNA etiketleme kıyasla çevre dostu daha güvenli ve daha yöntem sağlar. Kızılötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak EMSA postrun jel işleme adımlar gerektirir ve bu nedenle diğer DNA etiketleme teknikleri ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet tasarrufu yoktur. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
Referências
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
