We describe a method for generating localization and affinity purification (LAP)-tagged inducible stable cell lines for investigating protein function, spatiotemporal subcellular localization and protein-protein interaction networks.
Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this principle, the purification of critical proteins required for the functioning of these pathways along with their native interacting partners has not only allowed the mapping of the protein constituents of these pathways, but has also provided a deeper understanding of how these proteins coordinate to regulate these pathways. Within this context, understanding a protein’s spatiotemporal localization and its protein-protein interaction network can aid in defining its role within a pathway, as well as how its misregulation may lead to disease pathogenesis. To address this need, several approaches for protein purification such as tandem affinity purification (TAP) and localization and affinity purification (LAP) have been designed and used successfully. Nevertheless, in order to apply these approaches to pathway-scale proteomic analyses, these strategies must be supplemented with modern technological developments in cloning and mammalian stable cell line generation. Here, we describe a method for generating LAP-tagged human inducible stable cell lines for investigating protein subcellular localization and protein-protein interaction networks. This approach has been successfully applied to the dissection of multiple cellular pathways including cell division and is compatible with high-throughput proteomic analyses.
To investigate the cellular function of an uncharacterized protein it is important to determine its in vivo spatiotemporal subcellular localization and its interacting protein partners. Traditionally, single and tandem epitope tags fused to the N or C-terminus of a protein of interest have been used to facilitate protein localization and protein interaction studies. For example, the tandem affinity purification (TAP) technology has enabled the isolation of native protein complexes, even those that are in low abundance, in both yeast and mammalian cell lines1,2. The localization and affinity purification (LAP) technology, is a more recent development that modifies the TAP procedure to include a localization component through the introduction of the green fluorescent protein (GFP) as one of the epitope tags3. This approach has given researchers a deeper understanding of a protein’s subcellular localization in living cells while also retaining the ability to perform TAP complex purifications to map protein-protein interaction networks.
However, there are many issues associated with the use of TAP/LAP technologies that has hampered their widespread use in mammalian cells. For example, the length of time that is necessary to generate a stable cell line expressing a TAP/LAP tagged protein of interest; which typically relies on cloning the gene of interest into a viral vector and selecting single cell stable integrants with the desired expression level. Additionally, many cellular pathways are sensitive to constitutive protein overexpression (even at low levels) and can arrest cells or trigger cell death over time making the generation of a TAP/LAP stable cell line impossible. These and other constraints have impeded LAP/TAP methodologies from becoming high-throughput systems for protein localization and protein complex elucidation. Therefore, there has been considerable interest in the development of an inducible high-throughput LAP-tagging system for mammalian cells that takes advantage of current innovations in cloning and cell line technologies.
Here we present a protocol for generating stable cell lines with Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet) inducible LAP-tagged proteins of interest that applies advances in both cloning and mammalian cell line technologies. This approach streamlines the acquisition of data with regards to LAP-tagged protein subcellular localization, protein complex purification and identification of interacting proteins4. Although affinity proteomics utilizes a wide range of techniques for protein complex elucidation5, our approach is beneficial for expediting the identification of these complexes and their native interaction networks and is amenable to high-throughput protein tagging that is necessary to investigate complex biological pathways that contain a multitude of protein constituents. Key to this approach are advancements in cloning strategies that enable high fidelity and expedited cloning of target genes into an array of vectors for gene expression in vitro, in various organisms like bacteria and baculovirus, and in mammalian cells6,7. Additionally, the ORFeome collaboration has cloned thousands of sequence validated open reading frames in vectors that incorporate these advances in cloning, which are available to the scientific community8-11. In our system, the pGLAP1 LAP-tagging vector enables the simultaneous cloning of a large number of clones, which facilitates high-throughput LAP-tagging. This expedited cloning procedure is coupled to a streamlined approach for generating cell lines with LAP-tagged genes of interest inserted at a single pre-determined genomic locus. This makes use of cell lines that contain a single flippase recognition target (FRT) site within their genome, which is the site of integration for LAP-tagged genes. These cell lines also express the tetracycline repressor (TetR) that binds to Tet operators (TetO2) upstream of the LAP-tagged genes and silences their expression in the absence of Dox/Tet. This allows for Dox/Tet inducible expression of the LAP-tagged protein at any given time. Having the capability of inducible LAP-tagged protein expression is critical, since many cellular pathways are sensitive to the levels of critical proteins governing the pathway and can arrest cell growth or trigger cell death when these proteins are constitutively overexpressed, even at low levels, making the generation of non-inducible LAP-tagged stable cell lines impossible12.
Den skisserade protokoll beskriver kloningen av gener av intresse in i LAP-tagging vektor, generering av inducerbara LAP-taggade stabila cellinjer, och rening av LAP-märkt proteinkomplex för proteomik analyser. När det gäller andra LAP / TAP-märkning metoder, har detta protokoll effektiviserats för att vara kompatibel med hög genomströmning metoder för att kartlägga proteinlokaliserings och protein-proteininteraktioner inom någon cellulär väg. Detta tillvägagångssätt har i stor utsträckning till den funktionella karakteriseringen av proteiner kritiska för cellcykelprogression, mitotiska spindelenhet, spindel pol homeostas, och ciliogenesis för att nämna några och har hjälpt att förstå hur felaktig reglering av dessa proteiner kan leda till sjukdomar hos människor 15, 16,19,20. Till exempel, vår grupp nyligen utnyttjade detta system för att definiera funktionen och reglering av STARD9 mitotiska kinesin (en kandidat cancer mål) i spindelenheten 15,21, för att definiera ennytt molekylärt samband mellan Tctex1d2 dynein lätta kedjan och korta revben Polydactyly syndrom (SRP: n) 19, och att definiera en ny molekylär länk för att förstå hur mutation av Mid2 ubiquitin ligas kan leda till X-bundna intellektuella funktionsnedsättningar 16. Andra laboratorier har också framgångsrikt tillämpat denna metod, inklusive en som fastställt att Tctn1, en regulator av mus Hedgehog-signalering, var en del av en ciliopathy associerade proteinkomplex som reglerade ciliär membransammansättningen och ciliogenesis i en vävnadsberoende sätt 22,23. Därför kan detta protokoll tillämpas i stort sett dissektion av någon cellulär väg.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är valet av LAP-märkta stabila cellinjer som är Hygromycin resistenta. Särskild försiktighet bör vidtas för att säkerställa att alla celler i kontrollplattan är död innan du väljer fokus i den experimentella plattan för förstärkning. Hygromycin kan också added under rutin cellodling av LAP-märkta stabil cellinjer att ytterligare säkerställa att alla celler upprätthålla LAP-märkta genen av intresse vid FRT platsen. Vi varnar för att inte alla LAP-märkta proteiner kommer att vara funktionella och att det är viktigt att ha analyser på plats som kan användas för att testa proteiners funktion. Exempel på analyser används för att testa proteiners funktion inkluderar räddningen av siRNA-inducerad fenotyper och in vitro aktivitetsanalyser. För att hantera eventuella potentiella problem med tillsats av en stor LAP-tag, har vi tidigare genererat TAP-tag vektorer som är kompatibla med detta system som innehåller mindre taggar, såsom FLAG, som är mindre benägna att inhibera funktionen och lokaliseringen av proteinet av intresse 4. Dessutom finns det LAP märkning vektorer för generering av C-terminal LAP-märkta proteiner eller C-terminala TAP-taggade proteiner som är kompatibla med detta system, som kan användas i de fall där en LAP / TAP taggen inte tolereras vid N -terminalen av ett protein. Dessutom, the salt och tvättmedel koncentrationer av reningsbuffertar (LAPX N) kan modifieras för att öka eller minska renings stringens om ingen eller alltför många interaktioner observerats. På liknande sätt är strängare än enda reningsprocedurer och svaga Interactmedlemmar kan förloras tandem affinitetsreningsförfarande, således en enda reningsschema kan användas när några eller inga Interactmedlemmar identifieras.
Det är viktigt att notera att andra GFP epitop taggning metoder finns som tillåter storskalig GFP protein märkning för protein lokalisering och reningsstudier 24,25. Dessa inkluderar BAC TransgenOmics strategi som utnyttjar bakteriella artificiella kromosomer att uttrycka GFP-märkta gener av intresse från sin ursprungliga miljö som innehåller alla de regulatoriska elementen, som efterliknar endogena genuttryck 24. På senare tid har CAS9 / single-guided RNA (sgRNA) ribonukleoprotein-komplex (RNP) använts för att avslutaogenously märka gener av intresse med en delad GFP system som tillåter uttryck av GFP-märkta gener från sin endogena genomiska loci 25. Även om båda dessa tillvägagångssätt möjliggöra expression av märkta proteiner under endogena förhållanden, jämfört med LAP-märkningsprotokoll som beskrivs här, tillåter de inte för inducerbar och avstämbar expression av de taggade gener av intresse. Dessutom har de ännu inte tillämpas på tandem epitop märkning för TAP. Det är också viktigt att notera att andra taggsystem också kan modifieras för att bli kompatibel med det system som beskrivs här för att generera inducerbara epitopmärkta stabila cellinjer. Till exempel har närhet beroende biotin identifiering (BioID) rönt stor uppmärksamhet på grund av dess förmåga att definiera rumsliga och tidsmässiga relationer mellan interagerande proteiner 26. Denna teknik utnyttjar proteinfusioner till en promiskuös stam av Escherichia coli biotin-ligas BirA som biotinyleras varje protein i en ~ 10 nm radie av enzymet. De biotinylerade proteinerna är därefter affinitetsrenas med användning av biotin-affinitetsinfångning och analyserades beträffande sammansättningen med masspektrometri. BirA kommer biotinylera något protein i omedelbar närhet, till och med övergående, vilket gör den särskilt lämpad för att detektera svagare interagerande partners i en komplex 27. Dessutom gör reningsschemat inte nödvändigt att endogena protein-proteininteraktioner förbli intakt och kan utföras under denatureringsbetingelser, vilket minskar graden av falsklarm. Inom vår nuvarande protokollet, skulle ersättas av pGLAP1 vektorn genom en BirA-märkning vektor omvandla detta system från att identifiera protein-proteininteraktioner baseras på affinitet till att upptäcka dem bygger på närhet. Ett sådant system skulle vara mycket fördelaktigt för att detektera transienta proteininteraktioner som är fallet mellan många enzymsubstratinteraktioner och för att kartlägga Spatiotemporal protein-protein Interactions inom definierade strukturer som har genomförts för centrosom och cilier 26,28.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Science Foundation Grant NSF-MCB1243645 (JZT), any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
PETG, 5X | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
PETG, 2.5X | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
500 mL conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
4X Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |