Este manuscrito descreve um método fácil de usar e criofixação de baixo custo para a visualização de células em suspensão por meio de microscopia electrónica de transmissão.
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Artigo de método
Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) é uma ferramenta extraordinária para estudar a ultra-estrutura celular, a fim de localizar proteínas e visualizar complexos macromoleculares em resolução muito alta. No entanto, para chegar o mais perto possível do estado nativo, preservação amostra perfeita é necessária. fixação convencional microscopia electrónica (EM) com aldeídos, por exemplo, não proporcionar uma boa preservação ultraestrutural. A penetração lenta de fixadores induz reorganização de células e perda de vários componentes celulares. Portanto, a fixação EM convencional não permite para uma estabilização instantânea e preservação de estruturas e antigenicidade. A melhor escolha para examinar eventos intracelulares é usar criofixação seguido pelo método de fixação de congelamento e de substituição que mantém as células em seu estado nativo. congelamento de alta pressão / congelar-substituição, o qual preserva a integridade da ultra-estrutura celular, é o método mais vulgarmente utilizado, mas requer expensive equipamento. Aqui, um método fácil de usar e congelamento de fixação de baixo custo seguido de congelamento de substituição de culturas de células de suspensão é apresentado.
Introdução
A preparação da amostra é crítico para o sucesso de qualquer estudo de microscopia electrónica. EM convencional de fixação foi o principal método para a fixação de tecidos ou células por microscopia electrónica de transmissão (TEM) 1. Em primeiro lugar, aldeídos e tetróxido de ósmio são usados para fixar o material quimicamente à temperatura ambiente. Em seguida, o material é desidratado com solventes orgânicos, infiltrados e embebidos em resina epoxi. Este método é dependente da taxa de penetração de fixadores para dentro da célula. Por conseguinte, os artefactos e extracção de conteúdos celulares são geralmente observados
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Protocolo
1. Preparação de Formvar Grade Film
NOTA: Executar manipulação clorofórmio sob uma coifa utilizando equipamento de protecção individual (luvas, bata de laboratório, copos). Use 400 mesh grelhas de cobre de microscopia electrónica. Com outros tipos de grade (outros tamanhos de malha, ouro e grades níquel), a qualidade do congelamento é pior.
- Prepara-se uma solução de 100 mL de 0,3% formvar em clorofórmio. Permita que ele se dissolver durante a noite sem agitação.
- Coloque 400 malhas (série de furos por polegada quadrada) grelhas microscopycopper electrões (diâmetro 3,05 mm) em um frasco de vidro (altura de 3 cm e 2 cm d....
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Resultados
Neste artigo, um método de congelação fácil de usar e de imersão de baixo custo para ultra-estruturais (Figuras 1 e Figura 2) e estudos de imunomarcação (Figura 3) é apresentada. Nós demonstramos que não é necessário ter um equipamento especial para o processo de congelamento e de substituição e que o procedimento de aquecimento leva menos de 6 h, em vez das 24 h usando um sistema dedicado.
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Discussão
TEM é um método poderoso para a observação ultraestrutural de organelos, células e tecidos. Criofixação / congelamento-substituição é actualmente o melhor método para a preservação de ambos ultraestrutura e proteína antigenicidade. Fixadores químicos penetrar e actuar, desse modo permitindo que muito lentamente rearranjos estruturais antes da estabilização completa da ultra-estrutura 2. Por outro lado, a criofixação / congelamento-substituição estabiliza instantaneamente estruturas celulares
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Divulgações
Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesse.
Agradecimentos
Nós expressamos nossa gratidão a M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, e A. Devin por sua ajuda e comentários sobre o manuscrito. Somos gratos ao pólo imagens eletrônicas de Bordeaux Imaging Center, onde as imagens foram tiradas. Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de la Recherche Scientifique.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Grids | Microscopia Eletrônica Ciências | T400- | |
| Formvar | Microscopia Eletrônica Ciências | 15800 | |
| Propano N35 | |||
| Nitrogênio | |||
| Agulha de dissecação de borda dupla | Microscopia Eletrônica Ciências | 72947 | |
| Cryovials | Microscopia Eletrônica Ciências | 61802-02 | |
| Microscopia eletrônica | de tetróxido de ósmio | 19130 | |
| Frasco de vidro 8,5 mL | Microscopia eletrônica Sciences | 64252 | |
| Acetato de uranila | Microscopia eletrônica Sciences | 48851 | |
| Acetona | Sigma | 32201 | |
| Etanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Vidro slides | VWR international | 631-9439 | |
| Pinças | |||
| Resina acrílica | Microscopia eletrônica Ciências | 104371 | |
| Resina epóxi M | Sigma | 10951 | |
| Resina epóxi M endurecedor | Sigma | 10953 | |
| Dibutil ftalato | Sigma | 80102 | |
| Resina epóxi M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Cristalizador | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Copos | faça você mesmo, compre ou faça por você | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia coli | |||
| Caixa hermética | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Respirador purificador de ar | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartucho para respirador | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Filtro de partículas | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Referências
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixatio....
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Reimpressões e permissões
