O óxido nítrico (NO) é uma importante molécula de sinalização na homeostase vascular. A produção de NO in vivo é muito baixa para medição direta. A quimioluminescência fornece informações úteis sobre o ciclo de NO por meio da medição de seus precursores e produtos de oxidação, nitrito e nitrato. A determinação de nitrito / nitrato nos tecidos e fluidos do corpo é explicada.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência
Neste artigo
Resumo
Resumo
O óxido nítrico (NO) é um dos principais reguladores de moléculas na homeostase vascular e também um neurotransmissor. NO enzimaticamente produzido é oxidado em nitrito e nitrato por interações com várias proteínas oxi-heme e outras vias ainda não são bem conhecidos. O processo inverso, a redução de nitrito e nitrato em NO tinha sido descoberto em mamíferos na última década e está ganhando a atenção como um dos possíveis caminhos para prevenir ou aliviar toda uma gama de doenças cardiovasculares, doenças metabólicas e musculares que são pensados para estar associado a diminuição dos níveis de NO. É, portanto, importante para estimar a quantidade de NO e dos seus metabolitos em diferentes compartimentos do corpo - sangue, fluidos corporais e os vários tecidos. Sangue, devido à sua fácil acessibilidade, é o compartimento preferido utilizado para a estimativa de metabólitos. Devido à sua curta vida (alguns milissegundos) e baixa concentração de sub-nanomolar, medições confiáveis diretos de sangue NO <em> in vivo apresentam grandes dificuldades técnicas. Assim NO disponibilidade geralmente é estimado com base na quantidade de seus produtos de oxidação, nitrito e nitrato. Estes dois metabolitos são sempre medidos separadamente. Existem vários métodos bem estabelecidos para determinar as suas concentrações em fluidos biológicos e tecidos. Aqui é apresentado um protocolo para o método de quimioluminescência (CL), com base na detecção espectrofotométrico de NO após nitrito ou nitrato de redução de tri-iodeto ou de vanádio (III) soluções de cloreto, respectivamente. A sensibilidade para nitrito e nitrato de detecção é em baixa gama nanomolar, que define CL como o método mais sensível disponível atualmente para determinar mudanças na NO vias metabólicas. Nós explicar em detalhe como preparar amostras de fluidos e tecidos biológicos, a fim de preservar valores originais de nitrito e nitrato presente no momento da coleta e como determinar os respectivos montantes em amostras. Limitações da técnica CL também são explained.
Introdução
Nitrito, e um nitrato menos estender, os níveis no sangue refletem o estado geral do corpo NO metabolismo. concentrações de nitrito no sangue e a maioria dos órgãos e tecidos são apenas em nanomolar alta ou baixa gama micromolar, nitrato está normalmente presente em quantidades muito mais elevadas - na gama micromolar. Alterações nos níveis de nitrito devido à progressão da doença ou mudanças nos hábitos alimentares são bastante pequeno e só pode ser medido utilizando um método muito sensível. Por causa de seus níveis muito diferentes e diversos processos metabólicos, determinação separada dos níveis de nitrito e nitrato é essencial. Os chamados "NO x dete....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os protocolos, incluindo o uso de animais foram aprovados para uso pelo NIDDK Animal Care e do Comitê Use e sangue humano foi obtido a partir dos bancos de sangue NIH de doadores saudáveis.
Preparação 1. Amostra
- Preparação da solução de nitrito de preservação
- Prepara-se uma solução contendo 890 mM de ferricianeto de potássio (K 3 Fe (CN) 6) e NEM 118 mM (N-etilmaleimida) em água destilada. Dissolva bem até que fique claro amarelo sem cristais presentes. Adicionar NP-40 (octil phenoxylpolyethoxylethanol) em uma proporção de 1: 9 (v / v, NP-40 / solução). Misture com cuidado p....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A Figura 2 mostra resultados representativos recolhidos a partir de padrões e cinco amostras diferentes. Como mostrado nesta figura, os aumentos de tensão fotomultiplicador imediatamente após nitrito contendo a solução (padrões ou amostras) é injectado na solução redutora (injecções de tempos estão indicados por setas vermelhas abaixo da curva) e regressa ao valor basal, uma vez todos os nitritos presentes no injectado solução foi reduzida. É também evidente a partir des.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Passos críticos dentro do Protocolo
Alíquotas de todas as soluções (incluindo a água) utilizados para preparar, diluir ou de outro modo tratar amostras originais têm de ser salvo e devolvido para possível nitrito ou (mais frequentemente) contaminação por nitrato. Nós descobrimos que a maioria vem de contaminação de água e muitos produtos químicos utilizados para tratar a amostra (ferricianeto em particular) também contém quantidades significativas de contaminação de nitrato em alguns lotes que .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Dr. Alan Schechter está listado como um co-inventor de várias patentes emitidas para os Institutos Nacionais de Saúde para o uso de sais de nitrito para o tratamento de doenças cardiovasculares. Ele recebe royalties com base no licenciamento NIH destas patentes para o desenvolvimento clínico, mas nenhuma outra compensação.
Agradecimentos
Autores querem reconhecer contribuições críticas do Dr. A. Dejam e MM Pelletier no desenvolvimento do uso da solução de nitrito de preservação para as medições de nitrito no sangue.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ferricianeto de potássio; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-etilmaleimida | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-nonilfenil-polietilenoglicol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamida; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| ácido acético, glacial | Sigma | A9967 | |
| ácido ascórbico | Sigma | A7506 | |
| iodeto de potássio; KI | Sigma | 60399 | |
| iodo; I2 | Sigma | 207772 | |
| nitrito de sódio tóxico e sensível à luz; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| cloreto de vanádio(III); VCl3 | Sigma | 208272 | sensível à luz, tóxico |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecofísica |
Referências
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measure....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
