Измерение Распределение частиц по размерам в мутных растворах с помощью динамического рассеяния света микроскопии

Summary

Протокол для прямого измерения распределения частиц по размерам в концентрированных растворах с использованием динамического рассеяния света микроскопии представлена.

Abstract

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope¹ helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 µm when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Introduction

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 µm or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used^2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions⁴. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.

Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy^5,6, low-coherence dynamic light scattering^7,8, diffusing-wave spectroscopy^9,10, and differential dynamic microscopy^11,12.

We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope¹. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

Protocol

1. Подготовка образцов Очистка температуры реагирующих мономеров Растворить 20 г N -isopropylacrylamide (ПННА) в 100 мл толуола. Фильтр решение под вакуумом для удаления пыли. Смешайте фильтрат 500 мл петролейного эфира. Поместите реакционный сосуд в водяную баню со льдом. Раствор перемешивают до тех пор, пока мономеры осаждаются (обычно 30 мин). Фильтр решение при отсасывании, получая осажденных мономеров. Сушат мономеры при пониженном давлении (100 Па) в течение ночи. Приготовление раствора полимера температуры реагирующих Дега 20 мл деионизированной воды в течение 1,0 мин с использованием мембранного насоса. Растворить 780,8 мг очищенного NIPA в 9,5 мл дегазированной и деионизированной воды. Поместите реакционный сосуд в водяную баню со льдом. Щит реакциюсвет, покрывая устройство с алюминиевой фольгой. Раствор перемешивают осторожно в течение 10 мин при введении умеренный поток газа Ar мягко через кончик пипетки, прикрепленного к газовому баллону с трубкой. Добавить 11,9 мкл N, N, N ', N' тетраметилэтилендиамина к решению с помощью микропипетки. Раствор перемешивают в течение 1,0 мин при введении газа Ar, как уже упоминалось в пункте 1.2.5. При перемешивании образца, растворяют 4,0 мг персульфата аммония в 0,5 мл дегазированной и деионизированной воды. Смешайте раствор образца (со стадии 1.2.7) и раствора персульфата аммония (со стадии 1.2.8). Раствор перемешивают в течение 30 секунд при введении газа Ar, как уже упоминалось в пункте 1.2.5. Накройте решение с алюминиевой фольгой и держать его в холодильнике (4 ° C) в течение ночи. Подготовка образцов монтирует Поместите 60 мкл раствора образца (отшаг 1.2.11) в слайде полости. Накройте решение с круглой покровным стеклом. Будьте осторожны, чтобы не пузырьки воздуха ловушку. Удалите излишки раствора с помощью микропипетки и лабораторные салфетки. Печать образца с клеем. Пусть клей сохнуть при комнатной температуре (как правило, 6 ч). Подготовьте еще один слайд, заполненный 0,1% вес полистирола латекса (100 нм) диаметра частиц суспензии следующие шаги 1.3.1-1.3.4. Этот слайд используется в качестве стандарта. 2. Измерение размера частиц с динамического рассеяния света микроскопа Оптимизация инструмента Поместите полистирол суспензия латекса слайд (со стадии 1.3.5) на предметный столик инверсионного микроскопа. Боковая крышка стекла должна быть обращена вниз. Поместите заслонку луча в передней части детектора (в лавинный фотодиод и автокоррелятора). Нанесите лазерный луч (твердотельный лазер, λ = 488 нм, 30 мВт, непрерывноеволна) к образцу через линзы объектива (10 ×). Часть отраженного света проходит через зеркало запуска микроскопа и наблюдают с помощью ПЗС – камеры , установленной на боковой порт микроскопа (рисунок 1). Отрегулируйте высоту объектива, чтобы установить фокус на образце суспензии путем сдвига высоты объектива от низкого до высокого положения. Во время этой процедуры, отраженное изображение сфокусировано три раза: на поверхности покровного стекла, на границе раздела между покровным стеклом и образцом, а на границе раздела между образцом и дырочного предметное стекло. Установить фокальную точку между вторым и третьим пункта. Ослабление интенсивности рассеянного света, изменяя мощность лазера. Введем рассеянного света в детекторе путем удаления заслонку луча перед детектором. Данное устройство измеряет время корреляции интенсивности света. Установите обскуры (ф = 50 мкм) betwееп микроскоп и детектор для достижения конфокальной эффекта. Отрегулируйте положение пинхол, чтобы максимизировать интенсивность света на детекторе. Измеряют временной корреляционной функции интенсивности рассеянного света в течение 30 с при инициации работы коррелятора с помощью компьютера. Измеренная функция корреляции часто выражается в г (2) (т) – 1, где Т время корреляции 4 и , Здесь я (т) является интенсивность рассеянного света в момент т и (•••) T время усреднения. Время распада будет составлять около 0,1 мс. Регулировка фокальной точки для получения широкого диапазона значений начальной амплитуды временной корреляционной функции (г (2) (т = 0) – 1). Примечание: Начальная амплитуда сильно зависит от количества отраженного света. Перемещая координирующим паклюARD интерфейс между покровным стеклом и образцом, количество отраженного света возрастает. Для сильных световых рассеивателей, таких как полистирол латекс, начальная амплитуда может быть изменен от 0 до 1. Тем не менее, трудно установить начальную амплитуду, близкую к 1 для более распространенных растворов полимеров, так как интенсивность отраженного света намного больше, чем что рассеянного света. Применение обратного преобразования Лапласа ( с помощью ограниченного упорядочению программы CONTIN 13,14) к полученной временной корреляционной функции для получения функции распределения частиц по размерам. В тех случаях, когда начальная амплитуда устанавливается меньшим, чем 0,2, функция распределения гидродинамического радиуса покажет резкий пик около 100 нм, что в два раза превышает фактический радиус (см обсуждение для подробностей). измерение образца Установите температуру стадии до 25 ° C. Поместите слайд, подготовленный с поли-NIPA (PNIPA) Solutион (этап 1.3.4) на столик микроскопа. Мера времени функции корреляции интенсивности рассеянного света, выполнив шаги 2.1.4-2.1.8. Если начальная амплитуда больше, чем 0,2, отрегулировать фокусировку, чтобы сделать начальную амплитуду временной корреляционной функции менее 0,2 с шага 2.1.9. Небольшая начальная амплитуда упрощает анализ. Установите температуру стадии до 35 ° C и подождать, пока раствор не станет мутным. Температура ниже критического раствора (НКТР) из PNIPA раствора составляет 32 ° C 15. Мера временной корреляционной функции с помощью следующих шагов 2.1.4-2.1.8. Если это возможно, отрегулировать положение фокальной точки, чтобы сделать начальную амплитуду временной корреляционной функции меньше, чем 0,2. Для мутных растворов, их начальные амплитуды имеют тенденцию к увеличению, так как интенсивность рассеянного света увеличивается в то время как отраженного света остается постоянной. Применить обратное Лапласа transformatiна полученных временных корреляционных функций для получения функции распределения по размерам. Обратите внимание, что фактический размер составляет половину полученное значение в тех случаях, когда начальная амплитуда меньше, чем 0,2.

Representative Results

Время корреляционные функции интенсивности рассеянного света для полистирольных латексных суспензии (радиус частиц: 50 нм) были измерены при различных фокусных точках, как показано на рисунке 2 (а). Эти корреляционные функции были преобразованы в функции распределения гидродинамического радиуса по обратного преобразования Лапласа (см Рисунок 2 (б) и (с)). Используя ту же самую процедуру, временные корреляционные функции и функции распределения гидродинамического радиуса раствора PNIPA были получены при 25 ° С и 35 ° С соответственно. На рисунках 3 (а) и (б) показывают время корреляции функции интенсивности рассеянного света и соответствующие функции распределения частиц по размерам раствора PNIPA ниже (25 ° C) и выше (35 ° C) НКТР. Функции распределения частиц по размерам были получены с помощью обратного преобразования Лапласа, за которым следуюткоррекция частичного гетеродина. Средний гидродинамический радиус ниже НКТР составляет несколько десятков нанометров, что характерно для растворов полимеров. В отличие от этого, гидродинамический радиус выше НКТР составляет около 1,0 мкм. Этот результат согласуется с тем, что раствор мутный выше НКТР. Красные и синие линии на рисунке 3 представляют собой распределение по размерам PNIPA растворов , полученных сразу после и через 20 мин после раствора становился мутным, соответственно. На рисунке 3 (б) четко указывает на рост агрегации. Рисунок 1. Схематическое изображение динамического рассеяния света микроскопа. Точечным (РН), расщепитель луча (БС), поляризатор (Pol), и лавинные фотодиоды (ЛФД). Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотретьувеличенная версия этой фигуры. Рисунок 2. Представитель результаты для полистирола латекса суспензии. (А) Время корреляционные функции интенсивности рассеянного света для полистирольных латексных суспензии. Номинальный радиус составляет 50 нм, а концентрация составляет 0,1% мас. Два набора данных были получены из разных точек рассеяния. (Б), (в) соответствующие функции распределения размера для полистирольных латексных суспензии , полученные с помощью обратного преобразования Лапласа (а). Красная линия соответствует корреляционной функции времени, у которых начальная амплитуда составляет примерно 1,0, а синяя линия соответствует тому, что с начальной амплитудой, что составляет примерно 0,2. Горизонтальная ось была рассчитана без (б) и (с) с учетом эффекта частичного гетеродинирования (PHD), когда A << ; 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. Типичные результаты для решения PNIPA. (А) Время корреляционные функции интенсивности рассеянного света для решения PNIPA. (Б) соответствующие функции распределения размера для PNIPA раствора , полученного с помощью обратного преобразования Лапласа (а). Горизонтальная ось была рассчитана с учетом эффекта частичного гетеродини для каждого набора данных. Черная линия представляет собой данные, полученные при 25 ° С. Красная линия представляет собой данные, полученные после того, как только раствор становится мутным (35 ° C). Синяя линия представляет собой данные, полученные после измерения 20 мин красной линии./54885/54885fig3large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Начальная амплитуда временной корреляционной функции в значительной степени зависит от фокальной точки, как показано на рисунке 2 (а). Это , казалось бы , противоречит тому , что раствор однороден (для тонкого слоя на границе раздела фаз , за исключением) ^8. Это изменение в начальной амплитуды объясняется изменением количества отраженного света. Частичная теория гетеродина ¹⁶ предсказывает , что начальная амплитуда, А, рассеянный свет интенсивности, я _с, и интенсивность отраженного света, я _г, удовлетворяют следующему уравнению ¹

Это уравнение показывает , что чем больше я _г становится, тем меньше А становится. Таким образом, А снижается путем установки фокальное положение , близком к интерфейсу. Кажущаяся константа диффузии D _A чап быть получена путем подгонки временной корреляционной функции в случае монодисперсных решений:

где , Здесь п показатель преломления растворителя (воды, 1,33), θ является рассеянное угол (180 °), и λ является длина волны света (514,5 нм). Так как мы использовали геометрия рассеяния, значение Q фиксируется. Тем не менее, эта точка решается с использованием различных длин волн света. Пожалуйста, обратите внимание, что любой вид лазерного источника непрерывного излучения можно построить DLS микроскоп. Благодаря небольшому объему облучаемой, коэффициент ¹⁷ когерентности, по оценкам, более чем 0,99 и незначительна. Для полидисперсных растворов, функция распределения D _А получается с помощью обратного преобразования Лапласа. Частичные гетеродинный йeory также предсказывает , что D _A не совпадает с фактической константы диффузии D. Эти две константы диффузии удовлетворяют следующему уравнению:

Константа диффузии D превращается в гидродинамический радиус R _H , используя уравнение Эйнштейна-Стокса ^4. При А = 1, эта зависимость становится D _A = D. В этом случае, процесс преобразования данных является такой же, как для общего динамического рассеяния света. Красная линия показано на рисунке 2 (б) соответствует этому случаю. В противоположность этому , эта связь становится D _A = 0,5 D в пределе → 0. Таким образом, размер, по оценкам, в два раза больше фактического размера , когда А мало (практически, менее чем 0,2), как показано в синяя линия на рис 2 (б) </sЧонг>. Если мы знаем , что значительно мала, горизонтальная ось может быть смещена, как показано на рисунке 2 (с). В принципе, мы можем преобразовать D _A в D для любого значения A. На практике, однако, лучше , чтобы установить начальные амплитуда меньше , чем 0,2, так как простое приближение D _A ~ 0,5 D справедливо.

Видные особенности динамического светового микроскопа методом рассеяния были продемонстрированы с использованием раствора PNIPA. Конформации PNIPA ниже и выше НКТР была тщательно изучена с помощью малоуглового рассеяния нейтронов ^15,18. В противоположность этому , динамическое рассеяние света не был использован для анализа PNIPA выше НКТР из – за его помутнению ^19. Эта задача решается с помощью динамического рассеяния света микроскопа, как показано на рисунках 3 (а) и (б). Размер этих агрегатов составляет несколько &# 181; м, которые не могут быть получены либо малоуглового рентгеновского рассеяния нейтронов / или обычными методами светорассеяния. С временным разрешением измерений с использованием этой системы дают информацию о процессе агрегации при изменении температуры.

Недостатком динамического рассеяния света микроскопа также показано на рисунке 3. Для получения результата ниже НКТР, корреляционная функция времени сильно зависит от очень небольшого количества пыли настоящее время (черные линии на рисунке 3). Например, корреляционная функция времени не затухает полностью, даже с временами корреляции в порядке 1,0 с. Это происходит потому, что объем облучаются этим аппаратом (приблизительно 1,0 мкм), значительно меньше, чем у облученного с обычным динамическим устройством рассеяния света (приблизительно 100 мкм). В тех случаях, когда интенсивность рассеянного света слабый, сигнал затемняется шума, вызванного, например, с помощью Sмола количества пыли в растворе. Таким образом, три пика , показанные на рисунке 3 (б) не может иметь количественное значение , хотя общий порядок размера имеет смысл. Следует отметить, что такой слабый рассеиватель может быть измерена с помощью обычного динамического светорассеяния аппарата.

Мы показали, что динамическое рассеяние света микроскоп позволяет нам измерять как прозрачные, так и мутные образцы с такой же установкой. Поскольку длина оптического пути в образцах короток, этот метод может быть применен к сильным поглощающих свет образцов, таких как углеродных нанотрубок ²⁰ суспензий. Кроме того, в связи с его высоким пространственным разрешением, этот метод может быть применен к биологическим клеткам. Для его применения к биологии, этот метод также можно комбинировать с другими методами визуализации, такими как флуоресценция и обработки изображений комбинационного рассеяния. Таким образом, мы считаем, что динамическое рассеяние света микроскоп является мощным инструментом для широкого круга научных направлений.

Materials

N-isopropylacrylamide, 98%	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.	I0401
toluene, 99%	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	201-01876
petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-22565
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99%	Sigma	T9281
ammonium persulfate, 98%	Sigma	248614
polystyrene latex suspension, 1 wt%	Duke Scientific Corporation	3500A
argon	Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.		purity > 99.999 vol.%
cavity slide	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	83-0336
inverted microscope	Nikon Instech Co., Ltd.	ECLIPSE Ti-U
Thermo Plate	Tokai Hit CO.,Ltd	TP-108R-C
Ar-Kr ion laser	Spectra-Physics	Stabilite 2018
avalanche photodiode	ALV-GmbH	ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode
correlator	ALV-GmbH	ALV-5000/EPP