Denna studie beskriver en imaging-baserade mikro neutraliseringstest för att analysera de antigena relationer mellan virus. Protokollet använder en flatbäddsskanner och har fyra steg, inklusive titrering, titrering kvantifiering, neutralisering, och neutralisering kvantifiering. Analysen fungerar bra med nuvarande cirkulerande influensa A (H1N1) pdm09, A (H3N2), och B-virus.
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Mikro-neutralisation (MN) analyser används i virologi för kvantifiering av neutraliserande antikroppar och antivirala aktiviteter. Som ett alternativ av hemagglutination inhibition (HI) analyser, MN-analyser kan övervinna icke-antigena effekter påverkas av affinitetsförändringar av receptorbindande i influensavirus, som kan komplicera tolkningen av HI resultat 1,2,3. Fram till nyligen var de flesta MN-analyser baserade på cytopatiska effekter (CPE) eller enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) 4,5. MN analyser baserade på minskning fokus och plack utvecklades 1990 6,7,8. Plackreduktionsanalyser är baserade på att räkna synliga plack att kvantifiera infektivitet. Men bara visuella räknar täcka stora plack som är upplösningen av mänskliga ögon, trots att majoriteten av plack är små och osynliga för många aktuella cirkulerande virus. Denna ofullständig täckning kan orsaka betydande variationer mellan examinatorer och mellan experiment, vilket leder till incomparable resultat. Det är också omöjligt att använda metoden när vissa virus visar misslyckade infektion av enskilda celler eller mycket små plack.
Den dåliga räknings upplösning kan förbättras genom införande av en avbildande-baserat protokoll. Med framsteg inom teknik, optisk mikroskopi och hög genomströmning väl plattan läsare kan ge korrekta sätt att räkna de infekterade cellerna 9. Enligt en trans-belyst mikroskop, kan infekterade celler märkta med vissa markörer visualiseras genom deras absorption eller fluorescens kontrast i sub-cellulära upplösning. Ett prov kan sedan analyseras på en datorskärm.
Tyvärr, på grund av begränsningar i synfältet, är mer än hundra kakel bilder krävs för att täcka en enda brunn. Analysera en platta med 96 brunnar skulle kräva avbildning och behandling av cirka tiotusen bilder. En sådan mödosam process är tidskrävande och dyrt, och upplösningen fick är i släktenl onödigt för rutinmässig karakterisering av virusinfektioner. Laboratorier med en begränsad budget kan det hända att den metod uppbyggd kring en flatbäddsskanner ger en kostnadseffektiv, hög genomströmning alternativ.
I detta dokument beskriver vi en förbättrad plackreduktion MN analys som är lämplig för den antigena karakterisering av ett stort antal virus och för att kvantitativt mäta antivirala aktiviteter och neutralisering antikroppar. Analysen har flera fördelar: för det första är det ett avbildningsbaserad analys som kan mäta virusinfektioner på cellnivå, oberoende av plackstorlek. Räkna det totala infekterade cellpopulationen (ICP) inuti en brunn kraftigt ökar detektionskänsligheten, vilket gör det möjligt att karakterisera de virus med låg infektivitet. För det andra är en mer exakt kvantitativ titrering infördes före neutralisering för att bestämma mängden av tillfört virus. Den kvantitativa input-viruset minskar avsevärt variation mellan olika experiment och gör resultaten mer jämförbara mellan laboratorier. För det tredje, kan neutralisering titer bestämmas direkt genom att analysera bilder, vilket gör kvantifiering snabbt och användarvänligt. Slutligen tillhandahåller protokollet ett kostnadseffektivt och hög genomströmning alternativ med den erforderliga upplösningen och noggrannheten. Kvantifieringen är baserad på en flatbäddsskanner och fri mjukvara för databehandling. Hela installationen har ett litet fotavtryck och är sättas i de flesta laboratorier.
Protokollet presenteras i detta dokument består av fyra viktiga steg, inklusive virus titrering, titrering kvantifiering, virusneutralisation, och neutralisering kvantifiering. Virustitrering är en beredning experiment som bestämmer mängden ingångs virus som skall användas i neutralisation. Under en titrering, är ett antal virala koncentrationer anbringas på cellmonoskikt i en 96-brunnars platta. De infekterade cellerna därefter kvantifieras i avsnitt 2. Den virala dilution som producerar 20% -85% ICP i sin tur används som ingångs virus till motsvarande neutralisering i avsnitt 3. halter av neutraliseringen protokollet kvantifieras med hjälp av avsnitt 4. Experiment som följde ovanstående protokoll presenteras i Representativa resultat. Analysen har testats grundligt under de senaste två åren med de flesta av de nuvarande cirkulerande influensavirus, såsom A (H1N1) pdm09, A (H3N2), och B-virus. Resultaten av influensavirus karakterisering ingick i rapporterna för WHO samrådsmötet som gav rekommendationer om influensavacciner för användning på södra halvklotet i 2016 och på norra halvklotet 2016-2017.
I denna studie beskrev vi en avbildning baserad MN analys för att kvantifiera de verkliga antigen relationer mellan virus. Jämfört med andra plack-reduktionsanalyser, betonar metoden mätning av ICP av en hel brunn, vilket garanterar fullständig täckning av det infektiösa befolkningen. Dess oberoende plackbildning vidgar också tillämpningen av analysen för virus som kan bilda i huvudsak osynliga små plack eller som endast hanterar encelliga infektion. Därför är analysen kunna behandla fler virus och effekterna av ett bredare spektrum av antikroppar än HI, och det bidrar till mer omfattande återspegla de antigena likheter eller skillnader mellan virus 12. Till exempel när oseltamivirkarboxylat ingår, MN analysen påverkas mindre av NA-beroende bindning, vilket återspeglar de antigena skillnaderna mer exakt. Under utvecklingen av analysen gjordes stora ansträngningar gjorts för att förbättra experimentet konsistens, hastighet och detekteringkänslighet, bland annat genom att styra inmatnings virus genom kvantifieras titrering, avbildning i hög genomströmning med en flatbäddsskanner, och genomföra ett användarvänligt databehandling plattform. Resultaten har i allmänhet varit förenligt med och bekräftade de HI. Noterbart är resultaten visade också antigena skillnader mellan antigen drift varianter av senaste typ A och B vaccinvirus, liksom antigena förändringar som orsakas av kultur vald eller sporadiska förändringar, såsom G155E substitution i HA1 av vissa A (H1N1) pdm09 virus 12.
Protokollet matchade virus typ eller subtyp med valet av cellinjer som gav den starkaste infektion, vilket kraftigt förbättrade avbildningssignalen. Experimentell variation var jämnas med utformningen av dubbletter som balanseras med antalet testade antisera. Osäkerhet kan också komma från bildkvalitet, som främst påverkas av avbildningsanordningen. Ett anständigt färg flatbäddsskanner kan signiligt förbättra bildens kontrast och minska bullret. Mängden tillfört virus i neutraliseringen skall bestämmas kvantitativt i förväg från motsvarande titrering medan virus ändå behålla en liknande status. Under neutralisation, är antiserumet svar på en infektion normaliserad mot skillnaden mellan referens virus (VC) och bakgrundsnivån (CC). Noggranna mätningar av VC och CC är avgörande för en neutralisering experiment. Fler dubbletter rekommenderas (åtta dubbletter användes i Representativa resultat). Slutligen, att förstå programvara är avgörande för framgången av ett experiment. Mjukvaran har testats för rutinviruskarakterisering i WHO influensa Centre, Storbritannien för mer än två år. Detaljerade instruktioner för att hantera olika situationer finns i den kompletterande S1.
Denna MN analys är lämplig för applikationer där proverna täcker en extremely stort synfält men kräver endast måttlig avbildning upplösning. Den låga kostnaden och enkel installation gör systemet lätt tillgängliga för de flesta virologi laboratorier. Variationen i mätningar av samma prov var mindre än 3%, vilket ungefär definierar osäkerheten presenterad under avsökningen 11. Sådan reproducerbarhet är tillräcklig många virologiska studier och kan minskas ytterligare genom att ta medelvärdet bilder från flera skanningar.
Sammanfattningsvis visar denna studie en robust MN analys som kan rutinmässigt används i antigen studie och stödja HI uppgifter i detaljerade analyser av närvarande cirkulerande influensavirus, särskilt för halvårs urval av virus för att ingå i humanvacciner mot influensa.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
Trypsin | Sigma | T1426 | |
Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |