सभी जानवरों पर प्रयोगों पशु की देखभाल समिति, Radboud विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर, नीदरलैंड, (: 77073 RU Dec, 2011-021, प्रोटोकॉल संख्या) की मंजूरी दे दी जानवरों की देखभाल और उपयोग के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था। 1. Glia सेल अलगाव और संस्कृति नोट: यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल Vellis 19 मैकार्थी के काम पर और डी आधारित है, और माउस astrocytes के लिए एक बहुत ही इसी विस्तृत प्रोटोकॉल उपलब्ध 20 है। भ्रूण (E18) चूहे के दिमाग से cortical astrocytes के प्राथमिक संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए, एक गर्भवती चूहे का बलिदान करने की जरूरत है, भ्रूण गर्भाशय से काटा जा करने की जरूरत है, और दिमाग भ्रूण से अलग किए जाने की जरूरत है। एक T75 फ्लास्क भरने के लिए, 2 भ्रूण दिमाग से cortices संयुक्त होने की जरूरत है। एक विकल्प के रूप में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध और जमे हुए astrocytes खरीदा जा सकता है। T75 संस्कृति फ्लास्क तैयार पतला पाली-डी lysine (पीडीएल) मेंबाँझ, ultrapure 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पानी। पतला पीडीएल के 5 एमएल T75 संस्कृति फ्लास्क में जोड़े। बेंत की मार धीरे आसपास के पूरे विकास सतह गीला करने के लिए। 3 घंटे के लिए एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें। कुप्पी से पीडीएल aspirate। 5 एमएल बाँझ पानी के साथ कुप्पी 3x कुल्ला अपार पीडीएल हटा दें। पानी पूरी तरह से aspirate। कुप्पी छोड़ दो एक लामिना का प्रवाह हुड या तुरंत इस्तेमाल में सुखाने के लिए। Cortices के विच्छेदन 2% (वी / वी) बी 27 के पूरक के साथ Lebovitz एल 15 मध्यम: 50 एमएल विच्छेदन के माध्यम से तैयार। बर्फ पर रखें। एक प्रेरण कक्ष में चूहे isoflurane के साथ गहराई (छोटे Plexiglas बॉक्स) anesthetize जब तक श्वसन रहता है (~ 5 – 8 मिनट)। प्रेरण कक्ष से चूहे निकालें और तुरंत ग्रीवा अव्यवस्था से euthanized। 70% EtOH के साथ चूहे के पेट स्प्रे और अतिरिक्त पोंछ। बेनकाब और सीजेरियन secti के माध्यम से बांध से गर्भाशय हटानेकैंची 21 वर्ष की एक जोड़ी के प्रयोग पर। कैंची के साथ उनके एमनियोटिक थैलियों से व्यक्तिगत भ्रूण कट, ठंड विच्छेदन के माध्यम से भरा एक बाँझ पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण, और बर्फ पर रहते हैं। एक नया, बाँझ 6 सेमी पेट्री ठंड विच्छेदन मध्यम से भरा डिश के लिए फिर से भ्रूण स्थानांतरण। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण से दिमाग को निकालें। मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए, धीरे संदंश का उपयोग त्वचा और खोपड़ी दूर छील। धीरे पूरे मस्तिष्क बाहर निकालना और ताजा, ठंड विच्छेदन मध्यम के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण। नोट: पूरे दिमाग भ्रूण से विच्छेदित सेलुलर व्यवहार्यता को खोने के बिना कई घंटे के लिए बर्फ पर विच्छेदन माध्यम में संग्रहित किया जा सकता है। ठीक इत्तला दे दी वसंत कैंची या एक छुरी के साथ midline के माध्यम से काटने से प्रत्येक मस्तिष्क के दोनों गोलार्द्धों अलग करें। ध्यान से सीधे ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ तानिका बंद पट्टी। नोट: यह पूरी तरह से तानिका दूर करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। गुastrocyte संस्कृति का रोकता fibroblast संक्रमण है। Fibroblasts तेजी से कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं और अंत में अन्य कोशिकाओं विस्थापित होंगे। मध्यमस्तिष्क / स्ट्रिएटम और वसंत कैंची या एक छुरी के साथ घ्राण बल्ब निकालें। इसके अलावा हिप्पोकैम्पस (सी के आकार का संरचना है कि perimedian और कोर्टेक्स के लिए सम्मान के साथ दुम है) वसंत कैंची या एक छुरी के साथ दूर करने के लिए सुनिश्चित करें। 5 एमएल विच्छेदन के माध्यम से भरा एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में cortical गोलार्द्धों लीजिए। बर्फ पर रखें। Cortices की हदबंदी तैयार 2 एमएल सीए 2/2 मिलीग्राम + मुक्त हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) 0.25% trypsin के साथ (हदबंदी मध्यम)। 50 एमएल उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 15% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% के साथ (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (संस्कृति के माध्यम से) और फिल्टर बाँझ तैयार करें। ऊतक अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए तय है। सावधानी के रूप मेंऊतक ऊपर से संभव के रूप में विच्छेदन माध्यम के रूप में ज्यादा के समुद्री डाकू। 2 + / 2 मिलीग्राम + मुक्त HBSS (trypsin के बिना) 5 एमएल सीए के साथ ऊतक धो और ऊतक ट्यूब के नीचे व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। ध्यान से HBSS aspirate। 2 एमएल हदबंदी मध्यम जोड़ें और धीरे ट्यूब झटका ऊतक के आसपास एंजाइम मिश्रण करने के लिए। 5-10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं। ऊष्मायन के दौरान ट्यूब एक बार कुछ झाड़ ऊतक आंदोलन करने के लिए। इसके तत्काल बाद ऊतक एक 1000 μL विंदुक टिप का उपयोग triturate। के बारे में 800 μL को pipetter मात्रा निर्धारित करें। टुकड़े Aspirate और सीधे तरल पदार्थ रेखा से ऊपर ट्यूब के किनारे पर जबरदस्ती बेदखल। हालांकि, बुलबुले या झाग को कम करने की कोशिश करते हैं। दोहराएँ जब तक ऊतक पर्याप्त अलग है, के बारे में 15 – 20x। 8 एमएल संस्कृति के माध्यम trypsin निष्क्रिय करने के लिए जोड़ें। धीरे ट्यूब कई बार inverting द्वारा मिश्रण। एक 70 माइक्रोन सेल एक 50 मीटर के शीर्ष पर रखा झरनी के माध्यम से सेल निलंबन दर्राएल अपकेंद्रित्र ट्यूब। संस्कृति के माध्यम से 15 एमएल ट्यूब कुल्ला और सेल निलंबन के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम इकट्ठा करने के लिए सेल झरनी के माध्यम से मध्यम फिल्टर। सेल झरनी संस्कृति के माध्यम से एक बार कुछ कुल्ला। 25 एमएल – rinsing के बाद, अंतिम मात्रा के बारे में 20 होना चाहिए। 10 मिनट के लिए 200 XG पर गोली कोशिकाओं। ध्यान से जितना संभव हो उतना मध्यम aspirate, सेल गोली को छूने के बिना। एक 1000 μL पिपेट का उपयोग 1 एमएल मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं Resuspend। 11 एमएल prewarmed संस्कृति के माध्यम जोड़ें और (बुलबुले को रोकने के लिए) धीरे मिश्रण एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग। 5 एमएल संस्कृति के माध्यम से एक बार पीडीएल लेपित T75 फ्लास्क कुल्ला। मध्यम Aspirate और फ्लास्क सेल निलंबन हस्तांतरण। सभी कोशिकाओं निलंबन चढ़ाया जाता है में हैं, और हम यह आम तौर पर अनावश्यक, उन्हें गिनती करने के बाद से astrocytes निलंबन में अन्य कोशिकाओं से भेदभाव नहीं किया जा सकता हैं। के 5% सीओ 2 च माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कुप्पी की जगहया दो दिनों के लिए। विस्तार और astrocytes के रखरखाव के लिए प्रारंभिक चढ़ाना के बाद पहली बार 2 डी पूरे मध्यम बदलें। पूरे मध्यम बदलें बाद में हर 3 डी। हमेशा की कोशिकाओं को जोड़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक ताजा माध्यम prewarm। नोट: astrocytes की आवश्यकता 7 – लगभग 90% confluency (astrocytes microglia और oligodendrocytes शीर्ष पर झूठ बोल रही है और intermixed के साथ, एक घनी पैक tessellated monolayer के रूप में दिखाई देते हैं) तक पहुंचने के लिए 10 घ। astrocytes लगभग 90% confluency तक पहुँचते हैं, दूषित glial कोशिकाओं को हटाने के लिए कुप्पी हिला: इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और टोपी (phenolic) कसने या बंदरगाह कवर (फ़िल्टर्ड)। microglia निकालने के लिए, 1 घंटे के लिए 180 rpm पर एक कक्षीय मंच पर कुप्पी हिला। मध्यम aspirate। 5 एमएल पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से, महाप्राण के साथ एक बार कुल्ला और 12 एमएल संस्कृति के माध्यम के साथ बदलें। दूर करना।oligodendrocytes, फ्लास्क कक्षीय मंच करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस 7 घंटा की एक न्यूनतम के लिए हे / एन लौटने और 250 rpm पर हिला, लेकिन अधिमानतः। मध्यम aspirate। 5 एमएल पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से, महाप्राण के साथ एक बार कुल्ला और 12 एमएल संस्कृति के माध्यम के साथ बदलें। इनक्यूबेटर कुप्पी लौटें। 3 करने के लिए 1: 2 0.05% trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ जब 100% मिला हुआ, मानक प्रक्रियाओं का उपयोग astrocytes 1 के अनुपात में विभाजित है। 100% confluency पर एक T75 कुप्पी आम तौर पर कुल में लगभग 4.0 x 10 6 कोशिकाओं निकलेगा। इस कार्यक्रम के तहत, संस्कृतियों आम तौर पर प्रति सप्ताह में एक बार विभाजित किया जा सकता है। नोट: astrocytes confluency तक पहुँचते हैं, वे काटा और के रूप में प्रोटोकॉल 3.4 कदम में नीचे वर्णित hiPSC भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। astrocytes व्यवहार्यता का एक महत्त्वपूर्ण बिना किसी नुकसान के कम से कम एक बार विभाजित किया जा सकता है। वे संस्कृति में अप करने के लिए 2 महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है। अनुभव से, प्राथमिक भ्रूण दिन 18 चूहे astrocytes progressively टर्मिनली विभेदित हो जाते हैं और / या दोहराया बंटवारे के बाद व्यवहार्यता खो देते हैं। हालांकि यह भविष्य में उपयोग के लिए astrocytes फ्रीज करने के लिए संभव है, जब हम आवश्यक ताजा भ्रूण दिमाग से astrocytes को अलग-थलग करने के लिए पसंद करते हैं। 2. rtTA की पीढ़ी / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs नोट: reprogramming के साथ कारकों cMYC, Sox2, OCT4 और KLF4 हमारे प्रयोगों के लिए इस्तेमाल hiPSCs मानव fibroblasts की lentiviral पारगमन द्वारा घर में उत्पन्न किया गया। नोट: rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs की पीढ़ी के लिए, lentiviral वैक्टर स्थिरतापूर्वक hiPSCs के जीनोम में ट्रांसजीन एकीकृत करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Lentivirus के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल पहले से 22 प्रकाशित किया गया है। Lentiviral वैक्टर पैकेजिंग कि rtTA और Ngn2 lentivirus कणों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं के विवरण में प्रदान की जाती हैं <strong> सामग्री / उपकरण की तालिका। हस्तांतरण rtTA lentivirus के लिए इस्तेमाल किया वेक्टर pLVX-EF1α- है (TET-ऑन-उन्नत) -IRES-G418 (आर); यानी इस सदिश एंटीबायोटिक G418 के लिए एक प्रतिरोध एक विधान EF1α प्रमोटर के नियंत्रण के तहत उन्नत transactivator Tet पर और प्रदान encodes। हस्तांतरण Ngn2 lentivirus के लिए इस्तेमाल किया वेक्टर है pLVX- (TRE-thight) – (माउस) Ngn2-PGK-puromycin (आर); यानी इस सदिश murine neurogenin-2 एक विधान PGK प्रमोटर के नियंत्रण के तहत puromycin प्रतिरोध जीन एक Tet नियंत्रित प्रमोटर के नियंत्रण के तहत और के लिए जीन encodes। इसलिए, इन दो हस्तांतरण वैक्टर का उपयोग करके, एक hiPSC लाइन बनाया जा सकता है जिसके लिए murine neurogenin -2 की अभिव्यक्ति डॉक्सीसाइक्लिन के साथ मध्यम सप्लीमेंट द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। HiPSCs के पारगमन के लिए, lentivirus कणों के साथ सतह पर तैरनेवाला प्रयोग किया जाता है, यानी बुद्धि (पाठ के शेष में 'lentivirus निलंबन' के रूप में)Hout ultracentrifugation का उपयोग कर कणों ध्यान दे। प्लेट hiPSCs (1 दिन) नोट: संस्करणों है कि इस प्रोटोकॉल में उल्लेख कर रहे हैं कि मान hiPSCs एक 6 अच्छी तरह से थाली में संवर्धित कर रहे हैं और एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को काटा जाता है। इसके अलावा, यह माना जाता है कि कोशिकाओं को एक 12 अच्छी तरह से थाली के 12 कुओं में बाद में चढ़ाया जाता है। पतला BMM प्राप्त करने के लिए 1% (वी / वी) तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (BMM) के साथ 10 एमएल ठंड DMEM / F12 तैयार करें। 800 एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से BMM पतला μL जोड़ें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कम से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं। उपयोग से पहले, आरटी पर 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं। 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 9 एमएल DMEM / F12 और कमरे के तापमान पर 1 एमएल सेल टुकड़ी समाधान (सीडीएस) के साथ गर्म 15 एमएल आवश्यक 8 (E8) मध्यम। साथ रो जुड़े प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोध E8 मध्यम अनुपूरक। hiPSCs का खर्च मध्यम Aspirate एकडी hiPSCs के लिए 1 एमएल सीडीएस जोड़ें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट – 3 सेते हैं। माइक्रोस्कोप के नीचे की जाँच कोशिकाओं को एक दूसरे से अलग करने के लिए कि क्या कर रहे हैं। कुएं में 2 एमएल DMEM / F12 जोड़ें, धीरे से एक 1,000 μL विंदुक के साथ कोशिकाओं को निलंबित और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण। सेल निलंबन के लिए 7 एमएल DMEM / F12 जोड़ें। 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं स्पिन। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और तैयार E8 के माध्यम से 2 एमएल जोड़ने। एक सेल निलंबन जिसमें hiPSCs अलग कर रहे हैं (सेल clumps फार्म नहीं है) 15 एमएल ट्यूब के पक्ष के खिलाफ एक 1000 μL पिपेट की नोक लगा और धीरे कोशिकाओं resuspending द्वारा प्राप्त करते हैं। माइक्रोस्कोप कि क्या कोशिकाओं अलग कर रहे हैं के तहत की जाँच करें। कोशिकाओं (कोशिकाओं / एमएल) एक hemocytometer कक्ष का उपयोग की संख्या निर्धारित करते हैं। नोट: 80 पर एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से – कुल में 4.0 x 10 6 कोशिकाओं – 90% confluency आम तौर पर 3.0 निकलेगा। महाप्राण12 अच्छी तरह से थाली के कुओं से BMM पतला। 3.0 x 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं पतला। प्लेट 1 12 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के एमएल। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली हे / एन रखें। RtTA और Ngn2 lentivirus के साथ आईपीएस कोशिकाओं transduce (2 दिन) 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन कमरे के तापमान को साथ गर्म 12 एमएल E8 माध्यम। 8 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता E8 मध्यम करने के लिए रॉक अवरोध और polybrene साथ E8 मध्यम अनुपूरक। lentivirus निलंबन के साथ aliquots गला लें। lentivirus निलंबन के लिए 8 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए polybrene जोड़ें। खर्च मध्यम Aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए तैयार E8 माध्यम के 1 एमएल जोड़ने। और Ngn2 -lentivirus निलंबन – rtTA के विभिन्न मात्रा के साथ पारगमन प्रदर्शन करना। उदाहरण के लिए, transdu12 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए दोनों rtTA -lentivirus और Ngn2 -lentivirus निलंबन के 100 μL जोड़कर hiPSCs सीई। अन्य कुओं के लिए, 200 μL, 300 μL, 400 μL और 500 μL lentivirus के बजाय निलंबन 100 μL का उपयोग करें। 12 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं की hiPSCs transduced नहीं किया जाना चाहिए; वे चयन के दौरान नियंत्रण के रूप में काम करेगा। ध्यान दें: transductions अधिमानतः, दो प्रतियों में प्रदर्शन कर रहे हैं इतना है कि पारगमन दक्षता चयन की शुरुआत के बाद और अधिक सही अनुमान लगाया जा सकता है (प्रोटोकॉल कदम 2.2.4 देखें)। lentivirus निलंबन की राशि है कि कुशलतापूर्वक hiPSCs के बहुमत transduce के लिए आवश्यक है lentivirus निलंबन और hiPSC लाइन है कि प्रयोग किया जाता है की अनुमापांक पर निर्भर करता है। lentivirus निलंबन के 500 μL hiPSCs transduce के लिए – इस अध्ययन में, हम आम तौर पर 100 का उपयोग करें। 5% सीओ का माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली की जगह6 घंटे के लिए 2। 6 घंटे ऊष्मायन अवधि के अंत से पहले, 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 12 के साथ गर्म 12 एमएल E8 मध्यम एमएल Dulbecco फास्फेट बफर खारा (DPBS) आरटी के लिए। रॉक अवरोध करनेवाला के साथ E8 मध्यम अनुपूरक। बिताए E8 मध्यम aspirate। 1 एमएल DPBS के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक को धो लें। तैयार E8 माध्यम के 1 एमएल प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली हे / एन रखें। ताज़ा करे E8 मध्यम (3 दिन) 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन आरटी के साथ गर्म 12 एमएल E8 माध्यम। 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं से खर्च मध्यम Aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए तैयार E8 माध्यम के 1 एमएल जोड़ने। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली हे / एन रखें। Puromycin और G418 (- 8 दिन 4) के साथ चयन को पूरा करें नोट: कूल्हे की कोशिका विभाजन दर पर निर्भर करता हैचयन अवधि, जो बिंदु पर संस्कृतियों को विभाजित करने की आवश्यकता के दौरान 80% confluency – अनुसूचित जाति लाइन और lentiviral पारगमन की दक्षता, कोशिकाओं को 70 तक पहुंच सकता है। क्योंकि बंटवारे के समय अग्रिम में भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, यह प्रोटोकॉल में उल्लेख नहीं किया जाएगा। हालांकि, बजाय E8 मध्यम puromycin और G418 का उल्लेख सांद्रता के साथ पूरक ताज़ा करने के लिए, एक hiPSC संस्कृति (vitronectin में लिपटे प्लेटों पर चढ़ाना कोशिकाओं सहित) एक सामान्य hiPSC संस्कृति के रूप में विभाजित कर सकते हैं। एकमात्र अपवाद है कि E8 मध्यम चयन जारी रखने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं का उल्लेख सांद्रता के साथ पूरक होना चाहिए। 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन कमरे के तापमान को साथ गर्म 12 एमएल E8 माध्यम। चयन के लिए puromycin और G418 जोड़ें; एंटीबायोटिक दवाओं के विभिन्न मात्रा के चयन की अवधि (तालिका 1) के दौरान जोड़ रहे हैं। G418- और puromycin के प्रतिशत का आकलन करके पारगमन की दक्षता का अनुमानप्रतिरोधी कोशिकाओं। प्रतिरोधी कोशिकाओं के प्रतिशत का अनुमान करने के लिए, अलग अलग परिस्थितियों (संस्कृतियों lentivirus निलंबन के विभिन्न मात्रा के साथ ट्रांसड्यूस) के लिए मृत कोशिकाओं का प्रतिशत (nonresistant कोशिकाओं) का अनुमान है और nontransduced कोशिकाओं (कोशिकाओं है कि एक चयन नियंत्रण के रूप में सेवा) के लिए। [- (मृत कोशिकाओं का प्रतिशत) 100%] के रूप में प्रतिरोधी कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना। नोट: lentivirus निलंबन के विभिन्न मात्रा के साथ transductions दो प्रतियों में प्रदर्शन किया गया, तो पारगमन दक्षता और अधिक सही अनुमान लगाया जा सकता है। गैर transduced कोशिकाओं के साथ हालत एक चयन नियंत्रण के रूप में कार्य करता है; संस्कृतियों lentivirus निलंबन के विभिन्न मात्रा के साथ ट्रांसड्यूस के लिए मृत कोशिकाओं का प्रतिशत कम होना चाहिए। प्रतिरोधी कोशिकाओं की अनुमानित प्रतिशत hiPSCs की संभावना है कि दोनों transgenes के लिए सकारात्मक रहे हैं चुनने के लिए प्रयोग किया जाता है। सामान्य तौर पर, हम चुन पारगमन हालत से hiPSCs थे सेल के> 90%एस 5 डी चयन अवधि जीवित रहते हैं। hiPSCs का खर्च मध्यम Aspirate और कुओं के लिए तैयार E8 माध्यम के 1 एमएल जोड़ने। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली हे / एन रखें। G418 के अंतिम एकाग्रता Puromycin के अंतिम एकाग्रता 4 दिन 250 माइक्रोग्राम / एमएल 2 माइक्रोग्राम / एमएल दिन 5 250 माइक्रोग्राम / एमएल 2 माइक्रोग्राम / एमएल दिन 6 250 माइक्रोग्राम / एमएल 1 माइक्रोग्राम / एमएल 7 दिन 250 माइक्रोग्राम / एमएल 1 माइक्रोग्राम / एमएल दिवस 8 250 माइक्रोग्राम / एमएल 1 माइक्रोग्राम / एमएल तालिका 1: चयन अवधि के दौरान एंटीबायोटिक्स की सांद्रता। </stरोंग> दौरान चयन अवधि के 5 डी puromycin और G418 की सांद्रता। चयन करना बंद करो और नियमित रूप से संवर्धन (दिन 9 और बाद में) शुरू 5 डी चयन अवधि, संस्कृति सामान्य रूप hiPSCs rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs, अपवाद है कि कोशिकाओं के E8 मध्यम 50 ग्राम के अंतिम एकाग्रता / एमएल और puromycin के साथ की एक अंतिम एकाग्रता के लिए G418 के साथ पूरक है के साथ के बाद 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल। नोट: कोशिकाओं को अब एक बैकअप के रूप में सेवा करने के लिए (कोशिकाओं की cryopreservation के लिए मानक प्रोटोकॉल के अनुसार) जमे हुए किया जा सकता है। यह भेदभाव प्रोटोकॉल के reproducibility के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह कई भविष्य भेदभाव प्रयोगों के लिए rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs के एक ही बैच के उपयोग की अनुमति देता है। 3. 6 अच्छी तरह पर न्यूरॉन्स के लिए rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs के भेदभावMeas और ग्लास Coverslips नोट: इस प्रोटोकॉल में, जानकारी के लिए दो अलग अलग substrates, यानी 6 अच्छी तरह से Meas और कांच coverslips (9 रिकॉर्डिंग और 1 संदर्भ में अच्छी तरह से प्रति एम्बेडेड microelectrodes के साथ 6 स्वतंत्र कुओं से बना उपकरणों) पर rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs फर्क के लिए प्रदान की जाती हैं 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं। प्रोटोकॉल, हालांकि, आसानी से बड़े substrates के लिए (जैसे, 12 या 6 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं के लिए), अनुकूलित किया जा सकता सतह क्षेत्र के अनुसार उल्लेख मूल्यों को स्केलिंग द्वारा। Meas या कांच coverslips (0 दिन और दिन 1) तैयार दिन भेदभाव की शुरुआत से पहले, निर्माता की सिफारिश के अनुसार Meas बाँझ। आसंजन प्रोटीन पाली एल ओर्निथिन (पीएलओ) बाँझ ultrapure पानी में एक अंतिम एकाग्रता 50 माइक्रोग्राम / एमएल पतला। कोट एक 100 μL रखकर 6 अच्छी तरह से Meas के सक्रिय इलेक्ट्रोड क्षेत्रप्रत्येक कुएं में पतला पीएलओ के ड्रॉप। 24 अच्छी तरह से थाली बाँझ चिमटी का उपयोग कर के कुओं में coverslips रखें। पतला पीएलओ के 800 μL प्रत्येक कुएं में जोड़ें। उन्हें 1000 μL विंदुक टिप के साथ नीचे धक्का द्वारा फ्लोटिंग से coverslips रोकें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली हे / एन एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं। अगले दिन, पतला पीएलओ aspirate। 6 अच्छी तरह से Meas की कांच की सतहों और coverslips बाँझ ultrapure पानी के साथ दो बार धोएं। (6 अच्छी तरह से Meas के लिए) 20 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता और (कांच coverslips के लिए) 10 माइक्रोग्राम / एमएल ठंड DMEM / F12 में laminin पतला। इसके तत्काल बाद कोट प्रत्येक में 100 μL बूंद अच्छी तरह से रखने से 6 अच्छी तरह से Meas के सक्रिय इलेक्ट्रोड क्षेत्र। इसी तरह, 400 μL पतला laminin की 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में कोट करने के लिए coverslips जोड़ें। उन्हें 1,000 μL विंदुक टिप के साथ नीचे धक्का द्वारा फ्लोटिंग से coverslips रोकें। 5% सीओ 2 के माहौल में कम से कम 2 घंटे के लिए के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली सेते हैं। प्लेट hiPSCs (1 दिन) नोट: संस्करणों है कि कदम 3.2.1 में उल्लेख कर रहे हैं – 3.2.4 मान लेते हैं कि rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs 6 अच्छी तरह से थाली में सुसंस्कृत हैं और एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को काटा जाता है। संस्करणों है कि 6 अच्छी तरह से Meas और / या coverslips पर चढ़ाना कोशिकाओं के लिए आवश्यक हैं 6 अच्छी तरह से Meas और / या coverslips कि प्रयोग में इस्तेमाल कर रहे हैं की संख्या की संख्या पर निर्भर करता है; संख्या कदम 3.2.6 में निर्दिष्ट – 3.2.8 अलग प्रयोग आकार के लिए स्केलिंग अनुमति देते हैं। गर्म DMEM / F12, सीडी और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन आर / टी के साथ E8 माध्यम। 4 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता और E8 मध्यम रॉक अवरोध को डॉक्सीसाइक्लिन जोड़ें। RtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs का खर्च मध्यम Aspirate और 1 मीटर जोड़नेएल hiPSCs करने के लिए सीडी। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट – 3 सेते हैं। माइक्रोस्कोप के नीचे की जाँच कोशिकाओं को एक दूसरे से अलग करने के लिए कि क्या कर रहे हैं। कुएं में 2 एमएल DMEM / F12 जोड़ें, धीरे से एक 1,000 μL विंदुक के साथ कोशिकाओं को निलंबित और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण। सेल निलंबन के लिए 7 एमएल DMEM / F12 जोड़ें। 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं स्पिन। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और तैयार E8 के माध्यम से 2 एमएल जोड़ने। 15 एमएल ट्यूब के पक्ष के खिलाफ एक 1000 μL पिपेट की नोक लगा और धीरे कोशिकाओं resuspending द्वारा hiPSCs अलग कर देना। माइक्रोस्कोप कि क्या कोशिकाओं अलग कर रहे हैं के तहत की जाँच करें। कोशिकाओं (कोशिकाओं / एमएल) एक hemocytometer कक्ष का उपयोग की संख्या निर्धारित करते हैं। नोट: 80 पर एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से – कुल में 4.0 x 10 6 कोशिकाओं – 90% confluency आम तौर पर 3.0 निकलेगा। पतला laminin aspirate। 6 अच्छी तरह से Meas के लिए, एक सीई प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को कमजोर7.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के डालूँगा निलंबन। 6 अच्छी तरह से Meas के प्रत्येक कुएं में सक्रिय इलेक्ट्रोड क्षेत्र पर सेल निलंबन के 100 μL की एक बूंद जोड़कर कोशिकाओं थाली। Coverslips के लिए, 4.0 x 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को कमजोर। 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए सेल निलंबन के 500 μL जोड़कर कोशिकाओं थाली। नोट: Meas पर अंतिम सेल घनत्व coverslips (चित्रा 1 ए और बी) पर की तुलना में अधिक है। हमने पाया है कि इस उच्च घनत्व सेल नेटवर्क गतिविधि का उचित रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक था। प्रोटोकॉल में, संख्या प्रदान की जाती हैं कि बाहर कर दिया assays के लिए इष्टतम किया जाना है। 5% सीओ 2 का माहौल 2 एच (MEAS) या हे / एन (24 अच्छी तरह से थाली) के लिए के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली रखें। 2 घंटे के बाद, ध्यान से 6 अच्छी तरह से Meas के प्रत्येक अच्छी तरह से तैयार E8 माध्यम के 500 μL जोड़ें। 6-हम जगहMeas करूँगा हे / 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एन। (2 दिन) मध्यम बदलें अगले दिन, 1% (वी / वी) एन 2 के पूरक, 1% (वी / वी) गैर आवश्यक अमीनो एसिड और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ DMEM / F12 तैयार करते हैं। जोड़े मानव पुनः संयोजक neurotrophin-3 (NT-3) 10 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी / एमएल, पुनः संयोजक मानव मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) के अंतिम एकाग्रता, और 4 माइक्रोग्राम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए डॉक्सीसाइक्लिन के लिए / एमएल। 37 डिग्री सेल्सियस तक मध्यम गर्म। मध्यम से 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए laminin जोड़ें। जिसके परिणामस्वरूप मध्यम फ़िल्टर। 6 अच्छी तरह से Meas के कुओं से खर्च मध्यम और 24 अच्छी तरह से थाली Aspirate और तैयार मध्यम के साथ बदलें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली हे / एन एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं। चूहे astrocytes जोड़ें (3 दिन) <br/> नोट: संस्करणों है कि इस प्रोटोकॉल में उल्लेख कर रहे हैं कि मान चूहे astrocytes T75 संस्कृति बोतल में सुसंस्कृत हैं। यह महत्वपूर्ण है कि चूहे astrocytes संस्कृतियों के लिए जोड़ रहे हैं कि अच्छी गुणवत्ता के हैं। हम अगर चूहे astrocytes अच्छी गुणवत्ता के हैं जाँच करने के लिए दो मापदंडों का उपयोग करें। सबसे पहले, चूहे astrocyte संस्कृति चूहा भ्रूण दिमाग से अलगाव के बाद दस दिनों के भीतर मिला हुआ विकसित करने के लिए सक्षम होना चाहिए। दूसरा, चूहे astrocyte संस्कृति बंटवारे के बाद, चूहे astrocytes मिला हुआ, tessellated monolayer (चित्रा 1 सी) के रूप में करने में सक्षम होना चाहिए। चूहे astrocyte संस्कृति इन दो मानदंडों को पूरा नहीं करता है, तो हम भेदभाव प्रयोगों के लिए इस संस्कृति का उपयोग नहीं करने की सलाह है। गर्म 0.05% आरटी के लिए trypsin-EDTA। 37 डिग्री सेल्सियस (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 1% के साथ DPBS और DMEM / F12 गर्म। चूहे astrocyte संस्कृति का खर्च मध्यम aspirate। 5 एमएल DPBS जोड़कर संस्कृति को धो लें और धीरे आसपास बेंत की मार। AspirDPBS खाया और 5 एमएल 0.05% trypsin EDTA जोड़ें। धीरे चारों ओर trypsin-EDTA बेंत की मार। 10 मिनट – 5% सीओ 2 का माहौल 5 के लिए के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं। माइक्रोस्कोप कि क्या कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं के तहत की जाँच करें। कुप्पी एक बार कुछ मार से पिछले कोशिकाओं को अलग करें। DMEM / F12 के 5 एमएल कुप्पी में जोड़े। एक 10 एमएल विंदुक के साथ कुप्पी के अंदर धीरे कोशिकाओं Triturate। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए। 8 मिनट के लिए 200 XG पर ट्यूब स्पिन। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और DMEM / F12 के 1 एमएल में कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं (कोशिकाओं / एमएल) एक hemocytometer कक्ष का उपयोग की संख्या निर्धारित करते हैं। 6 अच्छी तरह से Meas की अच्छी तरह से प्रति 7.5 x 10 4 astrocytes जोड़ें। 24 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति 2.0 x 10 4 astrocytes जोड़ें। Meas और 24 अच्छी तरह से थाली हे सेते / एन 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में। (4 दिन) मध्यम बदलें <lमैं> 2% (वी / वी) बी -27 पूरक, 1% (वी / वी) एल alanyl-एल glutamine और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ Neurobasal मध्यम तैयार। 4 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी / एमएल, और डॉक्सीसाइक्लिन के अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी / एमएल, BDNF के अंतिम एकाग्रता के लिए NT-3 जोड़े। इसके अलावा, 2 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए साइटोसिन β डी arabinofuranoside जोड़ें। नोट: साइटोसिन β डी arabinofuranoside माध्यम से जोड़ा जाता है astrocyte प्रसार को बाधित करने के लिए और शेष hiPSCs कि न्यूरॉन्स में फर्क नहीं कर रहे हैं को मारने के लिए। मध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म फ़िल्टर। 6 अच्छी तरह से Meas के कुओं से खर्च मध्यम और 24 अच्छी तरह से थाली Aspirate और तैयार मध्यम के साथ बदलें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली बनाए रखें। (6 दिन – 28) मध्यम ताज़ा करें नोट: 6 दिन से शुरू, ताज़ा आधामध्यम से हर दो दिन। बाद दिन 10 से, मध्यम astrocyte व्यवहार्यता का समर्थन करने के FBS के साथ पूरक है। 2% (वी / वी) बी -27 पूरक, 1% (वी / वी) एल alanyl-एल glutamine और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ Neurobasal मध्यम तैयार। 4 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी / एमएल, और डॉक्सीसाइक्लिन के अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी / एमएल, BDNF के अंतिम एकाग्रता के लिए NT-3 जोड़े। दिन 10 के बाद से, यह भी 2.5% (v / v) FBS के साथ मध्यम पूरक। जिसके परिणामस्वरूप मध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म फ़िल्टर। 6 अच्छी तरह से Meas के कुओं और 24 अच्छी तरह से थाली एक 1000 μL पिपेट का उपयोग करने से खर्च मध्यम के आधे निकालें और तैयार मध्यम के साथ बदलें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली बनाए रखें। 4. hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की neurophysiological प्रोफ़ाइल स्थापित नोट: के बाद दो से तीन सप्ताहभेदभाव के duction, hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स अलग बहाव के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस खंड में, कुछ नीचे की ओर विश्लेषण के उदाहरण दिए गए हैं कि hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की neurophysiological प्रोफ़ाइल स्थापित करने के लिए किया जा सकता है। Meas का उपयोग कर न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधि विशेषताएँ रिकार्ड 20 Meas पर संवर्धित hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की electrophysiological गतिविधि के मिनट। रिकॉर्डिंग के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखने, और विदेश मंत्रालय पर humidified गैस (5% सीओ 2, 20% हे 2, 75% एन 2) के एक निरंतर, धीमी गति से प्रवाह inflating द्वारा माध्यम के वाष्पीकरण और पीएच परिवर्तन को रोकने । 1200x प्रवर्धन (विदेश मंत्रालय 1060, एमसीएस) के बाद, 10 kHz पर संकेत नमूना एमसीएस डाटा अधिग्रहण कार्ड का उपयोग कर। डेटा (कील और फट पता लगाने) एक कस्टम सॉफ्टवेयर पैकेज 23 का उपयोग कर विश्लेषण। एकल कोशिका electrophysiological गतिविधि विशेषताएँ </stronG> एक ईमानदार माइक्रोस्कोप में एक जलमग्न तय चरण रिकॉर्डिंग कक्ष hiPSC व्युत्पन्न neuronal संस्कृतियों युक्त कवर फिसल जाता स्थानांतरण। रिकार्ड 20 सहज कार्रवाई संभावित पैदा पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं (sEPSC) 24 मिनट। neuroscientific प्रोग्राम का उपयोग synaptic घटना का पता लगाने। न्यूरोनल आकृति विज्ञान और synapsin अभिव्यक्ति की विशेषताएँ फिक्स और MAP2 के लिए hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स दाग, synapsin-1/2, और PSD-95 22, 24, 25। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर synapsin-1/2 और PSD-95 puncta की संख्या यों।