Vi præsenterer en immunfluorescens imaging-metode til rumlig og tidsmæssig lokalisering af aktiv ERK i dissekeret C. elegans gonade. Den her beskrevne protokol kan tilpasses til visualisering af enhver signal- eller strukturelle protein i C. elegans gonade, forudsat en egnet antistofreagens er tilgængelig.
Den evolutionært bevaret ekstracellulære signal transducerende RTK-RAS-ERK-vejen er et vigtigt kinase-signaleringskaskade, der styrer flere cellulære og udviklingsmæssige processer hovedsagelig via aktivering af ERK, den terminale kinase af vejen. Tight regulering af ERK aktivitet er afgørende for en normal udvikling og homeostase; overdrevent aktive ERK resultater i overdreven cellulær proliferation, mens underaktiv ERK forårsager celledød. C. elegans er en kraftfuld model, der har været med til at karakterisere funktionen og reguleringen af RTK-RAS-ERK signalvejen under udvikling. Især RTK-RAS-ERK-vejen er afgørende for C. elegans germlinie udvikling, som er i fokus for denne fremgangsmåde. anvendelse af antistoffer specifikke for den aktive, diphosphorylated form af ERK (dpERK), den stereotype lokalisering mønster kan visualiseres i kimcellelinje. Fordi dette mønster er både rumligt og tidsligt Controlled, evnen til på reproducerbar analyse dpERK er nyttigt at identificere regulatorer af vejen, som påvirker dpERK signal varighed og amplitude og dermed kimcellelinje udvikling. Her demonstrerer vi, hvordan man med succes dissekere, bejdse, og image dpERK i C. elegans gonade. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til rumlig lokalisering af enhver signal- eller strukturelle protein i C. elegans gonade, forudsat et antistof kompatibel med immunofluorescens er tilgængelig.
Den receptortyrosinkinase (RTK) -rotte sarkom (RAS) -Extracellular signal kinase (ERK) pathway relæer ekstracellulære signaler gennem en konserveret kinase kaskade, der resulterer i phosphorylering og aktivering af ERK 1-3. ERK-proteinerne er medlemmer af det konserverede prolin-serin / threonin-MAP (mitogenaktiveret protein) kinase familien, og påvirkes direkte af MEK via dobbelt phosphorylering på threonin (T) og tyrosin (Y) i det konserverede TEY motiv. Aktiv ERK (benævnt diphosphorylated ERK, eller dpERK) regulerer derefter mange cellulære og udviklingsprocesser gennem sin fosforylering af et batteri af downstream substrater 1-3. Således unormal ERK aktivitet fører til mange celle og udviklingsmæssige defekter 4-7.
Stringent regulering af ERK-aktivitet er kritisk for normal udvikling: i mammale systemer for meget ERK aktivitet fører til overdreven cellulær proliferation førendetil onkogen vækst; for lidt aktivitet fører til celledød 4,6. Derudover kan ændringer i varigheden af ERK aktivitet også føre til forskellige resultater: i PC12-celler, ERK-aktivering i 30 minutter eller mindre inducerer celleproliferation, men ERK-aktivering i 60 minutter eller mere inducerer neuronal differentiering 8,9. Tight regulering af ERK aktivitet er således klart afgørende for en normal udvikling og homeostase.
C. elegans er en kraftfuld, og genetisk formbart model system til at dissekere funktion og regulering af RTK-RAS-ERK signalvej 3,10-15. I forhold til mammale systemer, der indeholder multiple gener for RAS og ERK, C. elegans indeholder en RAS genet (lad-60) og en ERK gen (mpk – 1), hvilket gør det til et genetisk mere facile system, hvor at dissekere funktionen af denne vej 3,10-14. C. elegans germlinie det væsentlige et rør, der består af mitotiskestamceller ved sin distale ende og modne oocytter ved sin proximale ende (figur 1) 16. Kimceller initiere meiose lige proximalt til den distale mitotisk zone og fremskridt gennem en udvidet meiotiske profase (pachytene), hvorefter de begynder at danne oocytter i loop-regionen, endelig undergår oocytmodning i det proximale område 16.
Genetiske undersøgelser fra flere laboratorier, herunder vores egen, har vist, at RTK-RAS-ERK vej er afgørende for germlinie udvikling i C. elegans 12,13,15,17-19. Specifikt fandt vi, at ERK kontrol og koordinerer mindst ni forskellige biologiske processer under germlinie udvikling, lige fra udviklingsmæssige omskiftere såsom kimcelle apoptose til celle biologiske processer såsom oocyt vækst 11,18. Meget gerne i mammale systemer, for meget ERK aktivitet i C. elegans germlinie resulterer i produktion af flere små oocytter, mens for little aktivitet medfører en stor oocyt 11. Således stram regulering af dpERK er afgørende for normal germlinie udvikling. Den aktive form af ERK, som visualiseret ved et antistof specifikt til dpERK, viser en stereotyp, dynamisk, bimodal lokalisering mønster: dpERK er høj i midten pachytene (Zone 1, figur 1), lav i løkkeregionen og høj igen i modne oocytter (Zone 2, figur 1). For nylig fandt vi, at ernæring virker gennem Insulin-lignende vækstfaktor-receptor-1 (daf-2) for at aktivere ERK i zone 1 12; tidligere arbejde viste, at sæd signal (via Ephrin receptortyrosinkinase) aktiverer ERK i zone 2 13.
Eftersom aktive ERK fungerer som en rheostat i kimcellelinje at regulere oocyt vækst, rumlig og tidsmæssig lokalisering samt amplituden af dpERK, er nøglen til at forstå dens normale signalering resultat. Brug den her beskrevne fremgangsmåde, ændringer istereotype lokalisering af dpERK kan nemt overvåges og forudsigelser udledt om virkningen af de miljømæssige eller genetiske forstyrrelser på ERK aktivitet og dermed funktion. Således analyse for dpERK giver en omfattende forståelse af sin rolle under kimcellelinje udvikling.
Aktiv ERK (dpERK) følger en stereotyp rumlige og dynamisk lokalisering mønster i C. elegans germlinie. Denne stereotype dpERK rumligt mønster (figur 5), og amplitude i en voksen C. elegans gonade, effektivt kan korreleres med mange biologiske processer, ERK regulerer. For eksempel, at en manglende evne aktivere ERK i zone 2 resultater i en anholdelse i oocytter i profasen af meiose, en fænotype observeret i kvindelige kønsceller, som ikke angiver sperm, og derfor ikke aktiverer ERK i modne oocytter (figur 5). Parring med hanner resultater i effektiv akkumulation af dpERK i zone 2 i de kvindelige kønsceller 11,13, kombineret med debut af oocyt modning og ægløsning. Således analyse af rumlige mønstre og tidsmæssig aktivering af dpERK på visse genetiske forstyrrelser (såsom RNA-interferens medieret gen inaktivering) eller kemiske behandlinger giver mulighed for identifikation af faktorer, forordsen ERK-signalering og dermed ERK-afhængige biologiske processer. Sådanne analyser også muliggøre opdagelsen af nye genetiske interaktioner mellem signalveje.
En kritisk flaskehals for enhver billeddannelse baseret analyse er tilgængeligheden af funktionelle reagenser, såsom antistoffer, der er specifikke for anvendelsen. Hvis en sådan reagens eksisterer derefter metoder som den ovenfor beskrevne kan let tilpasses til analyse af lokalisering mønster for ethvert protein af interesse. Ansøgningen er således begrænset af tilgængeligheden af en fungerende antistof. Desuden, fordi den metode beskriver dissektion og farvning på et givet udviklingsmæssige tid, det kun muliggør registrering af oplysninger på ét tidsramme, og ikke kaste lys over dynamikken eller protein regulering i realtid eller sats af protein omsætning.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde er tilpasset fra Francis et al. 23, som er forskellig fra Seydoux og Dunn metode 24 for gonadedosis ekstrudering og antistoffarvning. Metoden er baseret på Francis et al., Vil blive kaldt "suspension metoden", og Seydoux og Dunn metode kaldet "fryse revner metode" til sammenligning. Suspensionen metode har været meget effektive i vores hænder for at opnå reproducerbare lokalisering mønstre af signalmolekyler som dpERK, der i sagens natur er mere følsomme over for barske håndteringsforhold. I tilfælde af dpERK lokalisering, i vores erfaring, at signalet i zone 1 er næsten ikke målbart med fryse krakning metode. Derudover prøve tørring, som ofte kan forekomme med fastfrysningen krakning fremgangsmåde, resulterer i falske antistof-signaler. Suspensionen metode minimerer prøve tørring, eftersom gonaderne suspenderes i flydende under hele processen. Vi konstaterer også, at suspensionen er nyttig til billeddannelse af flere forskellige genotyper på en enkelt objektglas. For eksempel, hvis to genotyper, såsom hermafroditter vshunner er der direkte sammenlignes for dpERK lokalisering, de to genotyper kan blandes sammen og behandles. Dette er muligt, fordi de fænotyper er forskellige og kan skelnes via DAPI morfologier. Farvning i det samme rør efterfulgt af billeddannelse på samme glas giver mulighed for direkte sammenligning mellem gonaderne fra forskellige genotyper. Alternativt, hvis DAPI morfologier ikke skelnes, så en to-trins antistof farvning kan vedtages. Først hver enkelt genotype behandles med to forskellige antistoffer, antistof A for WT og antistof B for mutant (begge antistoffer skal rejses i en vært adskilt fra dpERK antistof). Når de to genotyper er farvet med det primære antistof, og vasket, kan de blandes sammen i et rør og nu farvet med dpERK antistof, efterfulgt af et sekundært antistof behandling for at visualisere alle antistofferne i røret. En evne til at sammenligne forskellige genotyper på en enkelt objektglas, især når deductions af aktiveringsmønstre der gøres sikrer præcise fortolkninger ikke er påvirket af forskellige farvning betingelser.
Mens fordelagtigt, der er flere trin i hele suspensionen metode, der kræver omhyggelig manipulation. Det er afgørende, at de dissektioner opstå i en tid effektiv måde; vigtigere, bør dissektioner ikke overtage 5 min. Længere dissektion gange resulterer i variabel dpERK signal, som ofte kan misfortolkes som regulerede ændringer i ERK aktivering, og ikke som tekniske fejl. Det er afgørende at starte med over 100-150 dyr i hver dissektion fordi hele forskellige vask trin gonaderne kan nemt tabt fra rørene på grund af pipetteringsfejl. Tab af gonader kan reduceres enten ved at dissekere i multiple små partier (såsom tre partier af 50 dyr hver), der kan kombineres, eller ved at dissekere en stort parti af 150. En anden udfordring er at få gonaderne til at ligge i et godt fordelte dannelsepå objektglasset, således at hele distale gonadedosis kan afbildes. For at aktivere dette, skal du bruge en øjenvippe på en tændstik eller en trukket pipette til rummet ud gonaderne. Imidlertid bør man være omhyggelig for ikke at beskadige gonaderne under denne proces. Ofte med disse teknikker, det tager flere forsøg på at mestre de dissektioner samt arrangementer af gonaderne onto dias.
Når denne teknik er styr på den, det tjener som en kraftfuld fremgangsmåde til varieret biologiske analyser, og kan bruges til at studere mere end bare dpERK niveauer. For eksempel denne metode kan anvendes til at visualisere aktive p38-niveauer, eller aktive CDK niveauer, eller helst protein, for hvilket der findes et antistof reagens. Derudover kan fremgangsmåden være koblet med en kemisk hæmning skærm i hele dyr til analyse for hidtil ukendte inhibitorer eller aktivatorer af vejen, via analysere for dpERK niveauer. Dette vil muliggøre en in vivo udlæsning af både reaktion og følsomhed over for eventuelle inhibitorer, som kan interact med RTK-RAS-ERK signalvej. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes i antistof kombinationer med flere signaludgange, som alle kan anvendes og visualiseres på én gang. Brug af flere antistoffer tillader korrelation mellem flere veje, deres aktivering status, og resultater alle inden det samme væv, hvilket muliggør en bedre forståelse af disse interaktioner. Disse er blot nogle få eksempler på yderligere anvendelser af denne metode, men dette system kan ændres til at studere flere forskningsinteresser.
The authors have nothing to disclose.
Work in the Arur Lab is supported by grants from the National Institutes of Health, NIHGM98200; Cancer Prevention Research Institute of Texas, CPRIT RP160023; the American Cancer Society Research Scholar Award (ACS RSG014-044-DDC); and by the Anna Fuller Funds.
Agarose | Sigma Inc. | A9539 | Dissolve 2 g in 100 ml to make the 2% agarose |
Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass, because dissected gonads often stick to plastic |
25 gauge needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
Syringes (could be 1 or 5 ml) | BD Syringes | 1 ml: BD 309659 | |
Microscope slides (25mm x 75mm x 1.0mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
Coverslips (24x50mm) | Corning | 2935-245 | |
5ml glass conical tube | Corning | 8060-5 | |
9" disposable Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20D | |
Clinical bench top centrifuge | |||
Glass tubes (6x50mm) | Fisherbrand | 14-958-A | |
*M9 solution | |||
Levamisole | Sigma | L9756 | |
3% Paraformaldehyde | Electron microscopy services | 17500 | Obtained as 16% solutions in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer |
**PBS | |||
1X PBST | 1X PBS with 0.1% Tween 20 | ||
Methanol | Electron microscopy services | 18510 | |
Normal goat serum (NGS) | Cell Signaling | 5425 | Diluted to 30% in 1x PBST |
MAPKYT (dpERK) antibody | Sigma Inc. | M9692 | Dilution 1:400 in 30% NGS |
Secondary antibody | Invitrogen | A-11005 | Dilution 1:500 in 30% NGS |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
*M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. | ||
**PBS (1X) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2.2H2O, 0.10 g MgCl2.6H2O, H2O to 1 litre | ||
Nematode Growth Medium (NGM) | 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 minutes. Cool, and add 1 mL of 1M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1M MgSO4 and 25 mL of 1M KPO4. |