Kombiniert intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie der Maus Megalosauridae Insulin-induzierte Vasodilatation und Muskel-Durchblutung zu untersuchen

Summary

Insulin-induzierte Vasodilatation regelt die Durchblutung der Muskeln und erhöht die mikrovaskuläre Fläche (mikrovaskuläre Rekrutierung) verfügbar für gelöste Austausch zwischen Blut und Gewebe Interstitium. Kombinierte intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie wird präsentiert, um gleichzeitig Insulinwirkung auf größere Schiffe und die Mikrozirkulation bewerten in-vivo.

Abstract

Es wurde nachgewiesen, dass Insulin die vaskuläre Aktionen zur Regulierung von Insulin-Empfindlichkeit beitragen. Insulin Auswirkungen auf die Durchblutung der Muskulatur regulieren postprandialen Lieferung von Nährstoffen und Hormonen zu Insulin-empfindlichen Geweben. Hier beschreiben wir eine Technik zur intravitalen Mikroskopie (IVM) und Kontrast-verstärkte Sonographie (CEUS) der Adduktoren Abteil des Maus Megalosauridae gleichzeitig Muskel Widerstand Arterien zu visualisieren und Durchblutung des kombiniert die Mikrozirkulation in-vivo. Gleichzeitig bewerten Insulin Wirkung auf mehreren Ebenen der vaskuläre Struktur ist wichtig, Beziehungen zwischen Insulin mehrere vasoaktive Effekte und Muskel-Durchblutung zu studieren. Versuche in dieser Studie wurden an Mäusen durchgeführt. Erstens ist die Rute Vene Kanüle zur Infusion von Anästhesie, vasoaktive Substanzen und Ultraschall-Kontrastmittel (Lipid-gekapselte Mikrobläschen) eingeführt. Zweitens wird ein kleiner Einschnitt in der Leistengegend gemacht, den arteriellen Baum des Fachs Adduktoren-Muskeln aussetzen. Die Ultraschallsonde wird dann am kontralateralen oberen Megalosauridae die Muskeln im Querschnitt anzeigen positioniert. Um grundlegende Parameter zu bewerten, bemisst sich des arteriellen Durchmessers und Mikrobläschen werden anschließend mit einer konstanten Rate abzuschätzen Muskeldurchblutung und mikrovaskuläre Blutvolumen (MBV) infundiert. Wenn vor und während einer Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klemme angewendet, können kombinierte IVM und CEUS Bewertung der Insulin-induzierte Veränderungen des arteriellen Durchmesser, mikrovaskuläre Muskel Perfusion und Ganzkörper-Insulin-Empfindlichkeit. Darüber hinaus kann die zeitliche Beziehung zwischen Antworten der Mikrozirkulation und der Widerstand Arterien auf Insulin quantifiziert werden. Es ist auch möglich, Follow-up der Mäuse längs in der Zeit, so dass es ein wertvolles Instrument, um Veränderungen in der Gefäß- und Ganzkörper-Insulinempfindlichkeit zu studieren.

Introduction

In Reaktion auf einen Anstieg des Blutzuckerspiegels sondert die Bauchspeicheldrüse Insulin in die Blutbahn, wo es schnell an seine Zielgewebe wie Skelettmuskel, über Widerstand Arterien und Kapillaren verteilt wird. Skelettmuskulatur ist verantwortlich für ~ 80 % der postprandialen Glukose Aufnahme¹. Die Lieferung von Insulin an der Skelettmuskulatur Interstitium hat sich gezeigt, zu einer Rate, die Begrenzung der Schritt für die metabolische Aktionen von Insulin, die Glukose zur Verfügung^2,3,4zu fördern. Innerhalb von 10-15 min erhöht Insulin Kapillare Blutvolumen (mikrovaskuläre Rekrutierung), ein Effekt, der Auftritt vor insgesamt Blutfluss^{5,6 erhöht}. Mikrovaskuläre Rekrutierung erweitert die endotheliale Oberfläche für Austausch von Nährstoffen (und Insulin)^7,8verfügbar. Insulin-vermittelte mikrovaskuläre Rekrutierung vorausgeht und ist unabhängig von Änderungen im skelettartigen Muskel Glukose Aufnahme^8,9zugeordnet. Die Wirkung des Insulins auf das Gefäßsystem hat “vaskuläre Insulin Sensitivity” bezeichnet worden.

Es hat sich gezeigt, dass die Insulin-vermittelte mikrovaskuläre Rekrutierung und Insulin-induzierte Vasodilatation bei adipösen Zucker Ratten^10,11beeinträchtigt sind. Darüber hinaus anzeigen schlanke Mäuse mit reduzierte Kapillardichte Muskel Insulin Resistenz¹² In ihrer einflussreichen Arbeit zeigten Kubota Et Al. , dass beeinträchtigte Insulin Signalisierung in Endothelzellen in Insulin-induzierte mikrovaskuläre Rekrutierung, bedingt die Glukoseaufnahme in der Skelettmuskulatur durch ca. 40 %¹³reduziert. Diese Anomalien in mikrovaskuläre Funktion auftreten nicht nur Muskeln, sondern auch in mehreren anderen Geweben und Organen wie Herz, Netzhaut und Niere^14,15,16. Diese Beispiele und andere Studien^17,18,19,20 legen nahe, dass vaskuläre Wirkung von Insulin ein wichtiges Instrument in der (Patho) Physiologie der Insulin-Resistenz sind und seine Komplikationen.

Zwar gibt es deutliche Hinweise, dass Insulin erhöht die mikrovaskuläre Blutvolumen (MBV) im Skelettmuskel^5,6, sind die Mechanismen, mit denen dies geschieht, nicht vollständig verstanden⁹. Endothel-abhängige Vasodilatation ist in vielen Aspekten der vaskulären Insulin Empfindlichkeit^21,22,23 auf verschiedenen Ebenen des Gefäßsystems unerlässlich. Vaskuläre Insulin-Empfindlichkeit kann manifestiert durch Insulin-induzierte Relaxation des Widerstand Arterien und durch Lockerung der Pre-Kapillare Arteriolen perfundierten mikrovaskuläre Austausch Fläche^{7,24zu erhöhen, 25}.

Intravitalen Mikroskopie (IVM) hat in einer Vielzahl von Gewebe Vorbereitungen einschließlich Hautfalte Kammern der Maus Dorsum²⁶, Mesenterium der Maus und Ratte²⁷, Modelle der Extremität Ischämie in der Maus-²⁸ und der Hamster Wange Beutel verwendet worden ²⁹. Kontrast-verstärkte Sonographie (CEUS) ist ein weiteres bildgebendes Verfahren, die Beurteilung der Mikrozirkulation in kardialen³⁰ sowie Skelettmuskulatur³¹ermöglicht. Es nutzt Inertgas gefüllten Mikrobläschen Verhalten rheologisch als rote Blutkörperchen und bleiben vollständig innerhalb der vaskulären Lumen. Diese Mikrobläschen sind intravenös infundiert mit einer konstanten Rate, einen stabilen Zustand zu erreichen. Eine hochenergetische Ultraschallwelle kann dann verwendet werden, die Mikrobläschen zu zerstören. Die Mikrobläschen Nachschub Geschwindigkeit in der Region of Interest (ROI) stellt Strömungsgeschwindigkeit (MFV). Die gesamte Signalintensität kontrastreiches Bild repräsentiert die MBV. CEUS wiederholt (auch beim Menschen) durchgeführt werden kann und es hat das Verständnis der vaskuläre Dysfunktion, das auftritt, in Insulin-beständigen Staaten (in Barrett Et Al. diskutiert fortgeschrittene ( ³²).

In der aktuellen Studie beschreiben wir eine neue Technik zur Regulierung der Muskel Perfusion durch gleichzeitige Nutzung von IVM und CEUS zu studieren. Hier konzentrieren wir uns auf Insulin vaskuläre Aktionen im Fach der Maus Megalosauridae Adduktoren. Dieses Fach ist einer der größten skelettartiger Muskel-Gruppen in der Maus, Studien der lokalen Glukoseaufnahme in einem repräsentativen Muskel. Dieses Fach ist ideal für IVM, da die Herstellung und Visualisierung der Arterien leicht zugänglich durch eine standardisierte Operationsverfahren^{28 sind}. Darüber hinaus haben unsere eigene Gruppe und andere gezeigt, dass CEUS in diesem Fach^33,34verwendet werden kann.

Ein Vorteil der kombinierten IVM und CEUS-Technik ist die Möglichkeit, Insulin Wirkung auf der Ebene der größeren Arteriolen (Feed oder Widerstand Arterien) und die Mikrozirkulation (Kapillare Betten) in den gleichen Muskel-Gruppe. Darüber hinaus bietet die gleichzeitige Anwendung der beiden Methoden einen Einblick in die zeitliche Wirkung des Insulins auf den Ebenen der Widerstand Arterien und Mikrozirkulation. Dies kombiniert IVM und CEUS Technik kann auch in anderen Bereichen vaskuläre Biologie umgesetzt werden. Beispielsweise kann die Rolle von verschiedenen Proteinen und bestimmten pathophysiologischen Bedingungen beeinflussen das Endothel mit Ko-Modelle untersucht werden. Darüber hinaus können beide Techniken in einer Maus zu mehreren Zeitpunkten reduzieren den Zeit- und Kostenaufwand der Forschung verwendet werden.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von den lokalen Tierpflege und Ethik-Ausschuß genehmigt. Das gesamte Protokoll von Induktion der Anästhesie in der Maus bis zum Ende der Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klemme dauert ca. 2 h. 1. mikrochirurgische Vorbereitung Anästhesie und Analgesie in einer männlichen Maus mit einem Gewicht von 20-25 g, ab 14 Uhr zu induzieren oder Übernachtung Fasten mit einer intraperitonealen Injektion von Fentanyl (0,31 mg/kg), Midazolam (6,25 mg/kg) und Acepromazine (6,25 mg/kg) (FMA-Anästhesie) und legen Sie es auf eine rektale Temperatur-gesteuerten homöotherm Heizkissen unterhält Körpertemperatur auf 37 ° C. Dem OP-Tisch und das Gerät mehrmals mit einer alkoholhaltigen Lösung zu desinfizieren. Legen Sie eine 27 G Nadel auf eine 10 cm lange Polyethylene-Rohr (PE-20) und befestigen Sie den Schlauch an einen 4-Wege-Connector. Stechen Sie die Nadel in die Vene Schweif und fixieren Sie es mit Gewebe Kleber Gel. Diese Kanüle wird für die Infusion von Mikroblasen, Insulin, Glukose und Anästhesie verwendet werden.Hinweis: Hinzufügen von Heparin (5 U/mL) in steriler Kochsalzlösung während der Kanülierung Prozess, spülen Sie die Rute Vene (ca. 10 µL) reduziert die Möglichkeit von verstopften Kanülen. Während der chirurgischen Eingriffen und experimentelle Protokolle aufrechterhalten Sie Anästhesie durch eine kontinuierliche intravenöse Infusion von FMA Anästhesie über die Rute Vene Kanüle mit Rate von 33.75 µL/kg/min. Legen Sie die Maus mit der Bauchseite nach oben und befestigen Sie die Füße mit einem thermostabile Band um die Oberschenkel-Bereich verfügbar zu machen. Verwenden Sie eine leichte Exorotation des Hüftgelenks (Megalosauridae Pfoten nach oben) und einem 40-60°-Winkel am Kniegelenk, um die Dehnung des Muskels auf das Fach der Adduktoren des Oberschenkels zu standardisieren. Entfernen Sie die Haare an der Leiste und Oberschenkel Bereichen bilateral mit einer Enthaarungscreme. Sammeln Sie alle lose Haare mit einem feuchten Wattestäbchen. Platzieren Sie den Mauszeiger unter einem Stereomikroskop und führen Sie die folgenden chirurgischen Schritte mit 10 X bis 16 X Vergrößerung. Machen Sie einen 2 cm Schnitt mit Haut-Schere, die parallel zur inguinalen Ligament, nur seitliche Bauch Krümmung (Abbildung 1). Tragen Sie Traktion auf der distalen Seite des Schnittes nach distal mit einem Bulldog-Klemme (Abbildung 1 auf). Dadurch wird das Fenster nach Bedarf anpassen und helfen, das Paraffinöl (siehe 1.12) zu halten. Das Fettgewebe von der Bauchwand zu sezieren. Um Blutungen zu vermeiden, trennen Sie vorsichtig die Fettpolster aus der Wand statt sezieren direkt über das Pad. Sanfte Traktion auf die Fettpolster in distale Richtung erleichtert den Prozess (Abbildung 1). Identifizieren der Femoral Arterie und folgen Sie ihm bis auf die ersten Hauptzweige (epigastrische Arterie und die Arterie Gracilis) (Abbildung 2). Die Gracilis-Arterie ist der erste großer Zweig der Femoral Arterie auf der Adduktor Magnus ausgeführt und läuft dann tief in den Muskel Gracilis. Die Gracilis Arterie wird für IVM verwendet werden. Identifizieren Sie die transparente tiefe Faszie für die Muskeln und Gefäße. Mit scharfen Pinzette, ziehen Sie die Faszie nach oben und schneiden Sie es mit einem Microscissor. Cover den freigelegten Muskel mit einem Tropfen (200 µL) von medizinischen Paraffinöl (Raumtemperatur, oder vorgewärmt auf 37 ° C) auf das vorbereitete Gewebe Austrocknen verhindert wird. Stellen Sie sicher, dass die Öltropfen entfernt nicht leckt. Passen Sie die Hautfalten des Schnittes mit der Bulldog-Klemme erstelle ich eine kleine Höhle um das Paraffinöl aufzunehmen, das die Schiffe badet. Platzieren Sie den Mauszeiger unter dem zuvor kalibrierten Mikroskop (16 X optische Vergrößerung) so, dass die Arterie Gracilis vertikal auf dem Bildschirm ist. Legen Sie das Mikroskop auf eine Kamera und Computer basierte Analysesystem, das die Gefäße Durchmesser aus dem Datensatz Bild extrahieren kann. Der Durchmesser beträgt der Abstand zwischen den beiden luminalen Seiten des Schiffes. Kontinuierliche Überwachung und Messung des Durchmessers Arterie ist wünschenswert. Legen Sie die Lichtquelle in ausreichendem Abstand (mindestens 20 cm) aus der Megalosauridae, Kopf Wärmeleitung vom Licht zu reduzieren. Die oberen kontralateralen Megalosauridae vorgewärmte Ultraschallgel Transduktion zuweisen. Legen Sie die Ultraschallsonde senkrecht zur Längsachse der Oberschenkelknochen. Stellen Sie vorsichtig den Winkel und Richtung von der Ultraschallsonde eine Querschnittsansicht des Arbeitskreises Adduktoren-Muskeln zu bekommen. Achten Sie darauf, um die Position von der Ultraschallsonde in Bezug auf die Maus, die gleichen Abbildungsebene für Basis- und Hyperinsulinemic Messungen zu halten stabil zu halten. Lassen Sie die Maus für 30 min zu stabilisieren. Der Durchmesser der Gracilis Arterie sollte vor dokumentieren die Grundlinie Durchmesser für 10 min stabil. 2. Baseline und Hyperinsulinemic Messungen Stellen Sie sicher, dass die Grundlinie Gracilis Arterie Durchmesser durch das Computerprogramm für die IVM verwendet gespeichert wird. Bereiten Sie die Mikrobläschen im Voraus als beschrieben35 und zählen mit Coulter Counter zu einer Konzentration von 2,5 x 109 Bläschen/mL kurz vor dem Experiment. Da die Mikrobläschen nur im Kontrast-Modus der Maschine Ultraschall angesehen werden können, Steuern die Parameter, die Einfluss auf das Bild Kontrast erhobenen Daten (beschrieben in 2.3.1) und Nutzung konsequent während der Akquisition. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen auf das Ultraschallgerät: Kontrast-Verstärkung am 35 Dezibel; der Zeitgewinn Entschädigung auf OFF; Liniendichte zu hoch; Anzahl der fokalen Zonen zu breit; Sendeleistung auf 4 %; Strahlbreite Standard zu übertragen; SV-Tor zum 4; Empfindlichkeit auf 1; Beharrlichkeit auf OFF. Ebene die Position des Focal Zonen zum Zentrum der Region von Interesse. Speichern Sie eine kurze (5 s) Clip. Hiermit wird das Hintergrundsignal zu berechnen. Schütteln Sie das Fläschchen mit der Mikroblasen von hand, um eine homogene Suspension zu haben. Starten Sie den Microbubbles mit der Rute Vene Kanüle mit einer 5 µL/min Rate Infusion. Legen Sie die Aufguss-Rohr auf einer vibrierenden Vortex (200 X / min.) um eine homogene Suspension von Mikroblasen zu erhalten. 5 min Dauerinfusion von Mikroblasen zu ermöglichen, so dass ein Steady State erreicht wird. Fahren Sie mit der Erlangung der Zeit-Intensität-Kurven der Bläschen mit der Mikroblasen Destruct Funktion (MBD) auf das Ultraschallgerät bei 5 min und 10 min nach Beginn der Infusion Mikrobläschen (Abb. 3A). Nehmen Sie die durchschnittliche Signal dieser beiden Messungen zu den Basisdaten der Perfusion. Beginnen Sie nach Erhalt der Baseline-Daten die Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klammer als beschrieben34. Verwenden Sie die Rute Kanüle (platziert in 1.3), die Insulin und Glukose (und Anästhesie) zu verwalten. Kurzum, induzieren einem Hyperinsulinemic Zustand durch die Einführung eines 200 mU/kg Insulin-Bolus gefolgt durch kontinuierliche Insulin-Infusion (7,5 mU/kg/min) für 60 min. verwenden eine Variable Infusion von 20 % D-Glucose, Euglycemia beizubehalten. Glukose im Blut aus der Vene Rute alle 5 min. mit einem Glukose-Monitoring-Gerät zu beurteilen und pflegen bei 5 mM durch die Variable Glukose-Infusionsrate anpassen. Insulin-Empfindlichkeit durch Mittelung der Infusionsrate bedeuten Glukose während der letzten 30 min zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass der Durchmesser der Arterie Gracilis auf die gewünschten Zeiträume (z. B. bei 10, 30 und 60 min) des Beginns der Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klammer mit dem Computerprogramm dokumentiert ist. Starten Sie nach 25 min/55 min der Insulin-Klammer, oder die zweite (Hyperinsulinemic) CEUS Messung um die MBV bei 30 bzw. 60 min, bzw. zu dokumentieren. Die gleichen Schritte in 2.4 und 2.5 beschrieben. Lösen Sie und verwenden Sie den Anästhesie-Anschluss der 4-fach-Steckverbindung, die Mikrobläschen einzuflößen. Befestigen Sie das Anästhesie-Rohr nach dem Ende der Mikroblasen-Infusion. Nach Abschluss der IVM und die CEUS Messungen 60 min nach dem Start der Insulin-Infusion Blut entziehen der Maus durch ein Herz durchbohren Verfahren zur späteren Analyse. Dies wird auch die Maus einschläfern. Sorgfältig sezieren Gracilis und Femoral Arterien und für weitere gewünschte Experimente zu speichern ( z.B.Western Blot, Immunohistochemistry, ex Vivo Druck Myographie experimentiert36,37, 38). (3) offline-Analyse Hinweis: Die Analysen der IVM und CEUS Messungen sollte durch eine verblindete Ermittler offline durchgeführt werden. CEUS bietet die Möglichkeit, die Mikrozirkulation von größeren Schiffen zu unterscheiden durch die Mikrobläschen von hoher Intensität Ultraschall-Wellen mit der MBD-Funktion vorübergehend zu zerstören. Das Signal (gemessen in beliebigen Einheiten (a.u)) in größeren Gefäßen ist schneller als in der Mikrozirkulation wegen der Mikroblasen-Geschwindigkeit in die entsprechenden Gefäße wiederhergestellt. Verwenden Sie eine offline-Workstation oder die Software auf das Ultraschallgerät Analysen zu tun. Zeichnen Sie eine Region von Interessen (ROI), die Mikrozirkulation aufzunehmen. Zeichnen Sie einen separaten ROI um die größeren femoralen Gefäße (Abbildung 3A) erweitert. Duplizieren Sie die Mikrozirkulation und größere Schiffe ROIs für den Hintergrund, Grundlinie und Hyperinsulinemic Messungen mithilfe von ROI-Copy-Funktion in die Software eingebaut. Subtrahieren Sie die Intensität Signal Hintergrundmessung von der Grundlinie und der Hyperinsulinemic Messungen. Teilen Sie die Intensität Signal der Mikrozirkulation durch die Intensität Signal der femoralen Gefäße. Baseline und Hyperinsulinemic MBVs können nun verglichen werden.

Representative Results

Glukose-Infusionsrate während der Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klemme (Insulin-Empfindlichkeit) war 180.21 ± 19,81 µmol/kg/min. lokale Anwendung von Paraffinöl auf das Adduktoren-Muskeln Fach, das Schiff zu stabilisieren änderte nichts an den durchschnittlichen Baseline-Durchmesser der Arterien (73,6 ± 29,0 µm vs. 68,8 ± 17,9 µm; p = 0,58) aber ermöglichte eine Reduzierung der Variation der Tiere untersucht (Abb. 4A). Insulin erhöht konsequent Gracilis Arterie Durchmesser (von 14,58 ± 6,2 % bei 60 min; N = 9) die war signifikant unterschiedlich (p < 0,0001) aus dem Durchmesser Wechsel verursacht durch Kochsalzlösung Infusion (-6,3 ± 4,9 %; N = 6). Insulin-induzierte Vasodilatation war spürbar nach 10 min (10,09 ± 5,1 %; p = 0,002) und etwa 95 % seiner maximalen dilatorisch Kapazität nach 30 min zu erreichen. Verwendung von CEUS, Insulin konsequent erhöhte Muskelmasse MBV (Abb. 5A) von 33,5 % (± 31.04 %, N = 7; p = 0,0009) im Vergleich zu Kochsalzlösung Infusion (-10.63 ± 27,87 %, N = 6) (Abb. 5 b). Die vorgelegten Daten sind die Signalintensitäten des Muskels MBV geteilt durch, die in der femoralen Gefäße. Dies reduziert die experimentelle Variation zwischen verschiedenen Messungen und zwischen verschiedenen Mäusen (Daten nicht gezeigt). Die Signalintensität in der femoralen Gefäße entspricht linear mit der Konzentration von Mikroblasen in der Zirkulation (Abbildung 3). Korrektur der femoralen Gefäße Signal theoretisch korrigiert für Konzentrationsunterschieden von Mikroblasen verwendet (Abbildung 3D). Daten werden in diesem Abschnitt als ± Standardabweichung bedeuten dargestellt. Abbildung 1: Chirurgische Exposition der Adduktoren Abteil des der Megalosauridae. (A) ein Einschnitt erfolgt an der Leiste, parallel zur Richtung inguinalen Ligament. (B) sanfte Traktion auf die Fettpolster in den distalen Richtungen (schwarze Pfeile) präsentieren das Bindegewebe (*) zwischen der Fettpolster und der Bauchwand. (C) die Haut Falten des Schnittes können eingestellt werden, mit der Bulldog-Klemme erstelle ich eine kleine Höhle um das Paraffinöl aufzunehmen, das die Schiffe badet. (D) die Ultraschall-Sonde befindet sich auf der kontralateralen oberen Megalosauridae, nachdem die vorbereitete Gracilis Arterie mit einem kalibrierten Mikroskop betrachtet wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Intravitalen Mikroskopie der Maus Megalosauridae. Die Femoral Arterie (A) ergibt sich die epigastrischen Arterie (B) und der Gracilis Arterie (C) verläuft über den Adduktoren-Muskel-Gruppe (D). Die Gracilis Arterie dient der IVM mit einem kalibrierten Mikroskop. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Signal Intensität der Kontrast verbessert Ultraschall in Blood mikrovaskuläre Muskelvolumen und femoralen Gefäße. (A) Blick auf die nichtlinearen Kontrast imaging-Modus der digital imaging Plattform während der Mikroblasen konstante Infusion in einer männlichen Maus obere Megalosauridae. Rechts: zwei ROIs werden gezeichnet, um den Muskel MBV und femoralen Gefäße darzustellen. Nur die oberflächliche Teil des Adduktoren-Muskeln Fach enthalten ist in der ROI als Signal Intensität nimmt mit Tiefe. Links: Zeit-Intensitätskurve aus dem Muskel MBV ROI. Vertikale Linien repräsentieren die Zerstörung von Mikroblasen (MBD) mit hohen Energiewellen. Unmittelbar nach der MBD ist kein Kontrastmittel in der Abbildungsebene beginnt die schrittweise mit Mikroblasen zu füllen. Nach 10-15 s wurde der Höhepunkt der Kontrastverstärkung erreicht. (B-D) Nachdem ein stationäres Signal erreicht wurde, verdoppelte sich die Infusionsrate von 2,5 x 109 Bläschen/mL (5, 10 oder 20 µL/min). Signalintensität von muscle MBV (B) und femoralen Gefäße (C) parallel die Verdoppelung der Mikroblasen Konzentration in den Blutkreislauf. (D) Korrektur Muskel MBV für femoralen Gefäße Signal die Variabilität Signalintensität, verursacht durch verschiedene Mikroblasen Konzentrationen entfernt (N = 9;-Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Intravitalen Mikroskopie Messungen der Gracilis Arterie. (A) Paraffinöl verringert die Variante der Gracilis Arterien von verschiedenen Tieren (die 29,0 µm ohne Paraffin Vs 17,9 µm ist nach dem Auftragen des Öls) unter Beibehaltung des durchschnittlichen Ausgangswert Durchmessers stabil (73,6 µm vs. 68,8 µm; p = 0,58). (B) arterielle Durchmesser bei Studienbeginn und nach 60 min. von Insulin oder Kochsalzlösung Infusionen. Insulin nach 60 min Infusion konsequent die Gracilis Arterie geweitet (p < 0,0001) im Vergleich zu Kochsalzlösung Infusion. (C) Insulin-induzierte Vasodilatation tritt bei 10 min nach Beginn der Infusion (p = 0,002) und erreicht 95 % der maximal bei 30 min. Fehlerbalken repräsentieren Standardabweichung; ungepaarte Student T-Test wird für Statistiken verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Mikrovaskuläre Blut-Volumen-Messungen mit Kontrast-verstärkte Sonographie von Adduktoren-Muskeln Abteil des Maus Megalosauridae. (A) Insulin führte eine konsequente Erhöhung der MBV 30 min nach dem Start der Insulin-Infusion. (B) die Differenz zwischen der Hyperinsulinemic und der Baseline-Messungen (MBV ändern) wird als die Insulin-vermittelte mikrovaskuläre Rekrutierung bezeichnet. Insulin induziert eine 33,5 % (± 31.04 %, p = 0,016; N = 7) mikrovaskuläre Einstellung gegenüber Kochsalzlösung Infusion (-10.63 ± 27,87 %, N = 6). Fehler-Balken stehen für Standardabweichung; ungepaarte Student T-Test wird für Statistiken verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Wir entwickelten eine Technik, um gleichzeitig Insulin vaskuläre Aktionen auf die größeren Arterien (mit IVM) und die Skelettmuskulatur Mikrozirkulation (mit CEUS) schätzen. Die entscheidenden Schritte für erfolgreiche und zuverlässige Messungen sind: 1) richtig aussetzen der Gracilis Arterie ohne Blutungen; (2) verhindert Auslaufen von Baden die Arterie Paraffinöl; (3), die einen patent venösen Zugang (Tail Vene Kanüle) für die Infusion von vasoaktive Substanzen (Insulin) und Kontrastmittel (Microbubbles).

Die Studie der mikrovaskulären Dysfunktion im Muskel gewinnt Aufmerksamkeit im Zusammenhang mit Übergewicht und Insulin Resistenz^14,25,39,40. Die negative Auswirkungen von Übergewicht und Insulinresistenz auf Gefäßfunktion manifestiert sich auf verschiedenen Ebenen der vaskuläre Struktur. Von nun an müssen verschiedene Ansätze, diese Änderungen zu beurteilen. Die kombinierte Verwendung der IVM und CEUS Techniken in der gleichen Maus ist ein leistungsstarkes Tool zur Quantifizierung der Insulin Wirkung auf verschiedenen Ebenen des Gefäßsystems. IVM ermöglicht die direkte Visualisierung und Quantitative Analyse der Widerstand Arterie und CEUS ermöglicht eine Beurteilung der Insulin-induzierte Veränderungen im Muskel-Durchblutung.

Das Adduktoren-Muskeln Fach zu studieren, hat mehrere Vorteile. Die Arterien sind leicht zugänglich und die oberflächliche Art des Schnittes macht es möglich, der Hautschnitt mit 5.0 sterile resorbierbare Naht zu schließen, nachdem das Experiment beendet ist. Die Tiere waren subkutan injiziert mit Buprenorphin nach den Experimenten als Analgetikum bei einer Dosis von 0,1 mg/kg und durfte in einer warmen Umgebung zu erholen. Die Mäuse das Verfahren sehr gut vertragen und wir erlebten kein Verlust von Tieren noch Infektionen die Megalosauridae in mehr als 35 Tiere untersucht. Dies macht es möglich, Follow-up oder die Tiere in einer longitudinal Mode zu studieren. In diesen Experimenten verwendeten Tiere wurden jedoch betäubt mit 1,8 % inhaliert Isofluran ausgewogen mit Sauerstoff fließt bei 0,4 L/min aber eine Anästhesie-Maske. Im Gegensatz zu Isoflurane Narkose^41,42stört die FMA Anästhesie nicht periphere Insulinsensitivität. Ein Plan für die Zukunft ist zu studieren, wie gut die Mäuse von FMA Narkose zu erholen.

Das Adduktoren-Muskeln Fach ist auch nützlich, da verschiedene vasoaktive Substanzen, die Vermittlung von lokalen und nachgelagerte vaskuläre Effekte können ausgewertet werden. Beispielsweise ist die topische Anwendung dieser Verbindungen auf das Zielgewebe machbar mit superfusion Techniken²⁸ oder chirurgische Manipulation und Implantation von medikamentenfreisetzenden Bündchen rund um die Schiffe⁴³. Darüber hinaus kann die Gracilis Arterie isoliert und studierte in der Druck-Myograph. Unsere Fraktion und andere sammelten sich erhebliche experimentelle Beweise mit der Druck-Myograph dokumentieren die Auswirkungen von Insulin und andere vasoaktive Substanzen auf diese Arterie ex Vivo^36,37,38.

Eine Einschränkung, die die Verwendung der IVM-Technik ist die chirurgische Exposition des Muskels und Anwendung von Paraffinöl, die Gefäße zu stabilisieren. Es ist nicht klar, ob diese Aktionen die native Umgebung der Arterie auswirken. Abbildung 3A zeigt jedoch, dass die Grundlinie Durchmesser der Gracilis Arterie in Paraffinöl gebadet nicht wesentlich ändert. Es hat auch gezeigt, dass Mineralöl erfolgreich die Diffusion von Sauerstoff, schützt das Gewebe vor Hyperoxic Bedingungen⁴⁴hemmt. Darüber hinaus hilft das Öl, um die Variation in der Baseline-Durchmesser der Arterien zu reduzieren. Deshalb befürworten wir Paraffin-Öl zu verwenden und die Vorbereitung mindestens 30 min. ruhen lassen. Der Hinweis führte die Verwendung von gepufferten Kochsalzlösung statt Öl – oder kein Öl überhaupt – in sehr Variablen Durchmessern und Verengung des Gefäßes (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus am Ende des Experiments, wir isoliert Gracilis Arterien – gebadet in Paraffin-Öl – und ihre Reaktivität in der Druck-Myograph getestet ex Vivo. Paraffin Öl gebadet Arterien reagierte ähnlich zur Steuerung der Arterien, wenn Sie mit Insulin und Acetylcholin (ein Vasodilatator) angeregt (Daten nicht gezeigt). Die konsequente Insulin-induzierte Vasodilatation zeigt deutlich, dass die IVM-Protokoll in dieser Studie beschriebenen zuverlässige Ergebnisse liefert.

Der Vorteil der Anwendung beider Techniken in der gleichen Maus überwindet einige der immanente Grenzen einer Technik von den anderen: CEUS schätzt MBV in ungestörten Muskel in-vivo, aber einzelne Schiffe nicht zu sehen; IVM macht es möglich, einzelne Schiffe zu sehen, wenn auch es nicht, MBV abschätzen kann. Ein Plan für die Zukunft ist IVM Mikroskopie des Cremaster-Muskel in Kombination mit CEUS Adduktor auf der kontralateralen Seite nutzen. Diese Änderung kann eine Schätzung der MBV (mit CEUS) und einen direkten optischen Zugang zu den Kapillaren (mit IVM) bereitstellen. Das Protokoll kann weiter geändert werden; der 4-Wege-Connector für die Heck-Kanüle verwendet umschaltbar auf einen 5-Wege-Connector. Dadurch können wir vermeiden, trennen die Anästhesie-Röhre während der Durchführung der zweiten CEUS-Messung (beschrieben unter Punkt 2.9). Nach unserer Erfahrung vertragen die Mäuse das aktuelle Protokoll gut. Eine weitere Modifikation, die dieses Protokoll vorgenommen werden kann, ist die Insulin Klemme verwendet. Wir verwendeten 7,5 mU/kg/min Klammer-Rate die supra-physiologischen betrachtet wird. Je nach Studie kann eine niedrigere Insulin Klemme Rate (z. B. 3 mU/kg/min) verwendet werden.

Während wir die beschriebene Protokoll zuverlässig gefunden haben, gibt es bestimmte Einschränkungen, die Aufmerksamkeit erfordern. Es gibt Situationen, wenn die Messung des arteriellen Durchmessers nicht optimal ist. Durchführung der vorbereitenden Maßnahmen erfordert einige Erfahrung mit dem Modell. Es ist wichtig, dass das Paraffinöl aus der Umgebung des Schiffes nicht leckt, stören das Schiff wird mit neuem Öl ergänzen und ändern Sie den Durchmesser, so dass es nötig ist, dass die Arterie ein weiteres 30 min ruhen lassen. Darüber hinaus war die Reflexion des Lichts auf der Oberfläche des Paraffin-Öl (beschrieben im Schritt 1.14 des Protokolls) manchmal zu hell, macht es schwierig, die Arterie anzeigen. Dies kann durch die Leitung der Lichtquelle, so dass das Licht in einem Winkel zu Paraffinöl Oberfläche und parallel zur Arterie fällt entgegengewirkt werden.

Die Kombination von IVM und CEUS Techniken, die in dieser Studie beschriebenen abschließend ermöglicht es, unterschiedliche Wirkung von Insulin auf verschiedenen Ebenen des Gefäßsystems zu quantifizieren. IVM der Gracilis Arterie gibt Einblick in die vorgelagerten Gefäßveränderungen zur nachgelagerten mikrovaskulären Perfusion mit CEUS gemessen. Wir setzen uns für die Kombination von mehreren experimentellen Techniken in der gleichen Maus besser beurteilen die Gefäßfunktion.

Materials

C57BL/6 Mice	Charles river		Mice used were bred in-house
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system	VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer	VisualSonics inc.
Vevo 2100 software	VisualSonics inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009	Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Vortex	VWR international	58815-234
Heating pad	Pantlab
Freestyle Precision Xceed	Abbott		To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp
Insulin Novorapid	Novo Nordisk
Glucose monohydrate	Merck Millipore	1083421000
Buffered saline solution	B. Braun	152118062
PE-20 medical tubing	Becton, Dickinson and Company	427405
Needle, 27 Gauge	Becton-Dickinson & Co	305109
Medical tape	3M
Ultrasound probe holder			Built In-house
Cotton swabs			Multiple Equivalent
Creme depilator			Multiple Equivalent
Gel tissue adhesive	Derma+flex	GA30005-2222
Infusion pump	Harvard Apparatus	Harvard Apparatus PHD 2000
Small fine straight scissors	Fine Science Tools (FST)	14090-09
Needle holder	Fine Science Tools (FST)	12500-12
Straight forceps with fine tip	Fine Science Tools (FST)	11251-20
Stereomicroscope	Olympus	SZX12
Camera	Basler	scA1390-17gc
Image Grabber program	Built in-house		Image acquisition system
Timer	VWR	33501-418
Syringes, 1 ml	Fisher	14-817-25
Light source, fiber-optic	Schott	KL1500	Ideally has adjustable arms
Paraffin oil			Multiple Equivalent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microbubbles
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850365C
polyoxyethylene stearate	Sigma	p3440
perfluorobutane gas	F2 Chemicals	C4F10(g)
Decon FS200 ultrasonic bath	Decon Ultrasonics Ltd
Vialmix	Lantheus Medical Imaging	515370-0810
Multisizer Coulter Counter	Beckman Coulter Inc