O estresse mecânico pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco, fornecendo uma abordagem terapêutica potencial para o reparo da cartilagem prejudicada. Apresentamos um protocolo para induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) usando gravidade centrífuga (CG). A regulação positiva de SOX9 induzida por CG resulta no desenvolvimento de fenótipos condrogênicos.
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Artigo de método
Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cartilagem prejudicada não pode cicatrizar naturalmente. Atualmente, a terapia mais avançada para defeitos na cartilagem é o transplante de condrócitos diferenciados de células-tronco por meio de citocinas. Infelizmente, a diferenciação condrogênica induzida por citocinas é cara, demorada e associada a um alto risco de contaminação durante a diferenciação in vitro. No entanto, os estímulos biomecânicos também servem como fatores reguladores cruciais para a condrogênese. Por exemplo, o estresse mecânico pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco, sugerindo uma abordagem terapêutica potencial para o reparo da cartilagem prejudicada. Neste estudo, demonstramos que a gravidade centrífuga (CG, 2.400 × g), um estresse mecânico facilmente aplicado por centrifugação, induziu a regulação positiva da região determinante do sexo Y (SRY)-box 9 (SOX9) em células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs), fazendo com que expressassem fenótipos condrogênicos. As ASCs centrifugadas expressaram níveis mais altos de marcadores de diferenciação condrogênica, como agrecan (ACAN), colágeno tipo 2 alfa 1 (COL2A1) e colágeno tipo 1 (COL1), mas níveis mais baixos de colágeno tipo 10 (COL10), um marcador de condrócitos hipertróficos. Além disso, a formação de agregados condrogênicos, um pré-requisito para a condrogênese, foi observada em ASCs centrifugados.
Introdução
Defeitos na cartilagem articular não curam naturalmente. Consequentemente, transplante de células estaminais tem sido proposto como uma abordagem promissora para a reparação de cartilagem deficiente. No entanto, este método requer a aquisição de um número suficiente de células estaminais e a indução destas células para sofrerem diferenciação condrogénica. medula óssea (MO) tem sido amplamente utilizado como uma fonte de células estaminais, mas o isolamento de células a partir de BM tem duas grandes desvantagens: a invasividade e rendimento insuficiente. Devido à sua facilidade de aquisição, o tecido adiposo é uma fonte preferida de células estaminais. Estudos anterio....
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Protocolo
Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC16EAME0162) e realizada de acordo com as diretrizes do NIH. Todos os tecidos foram obtidas com consentimento informado por escrito.
1. centrífugas Gravidade carregar e Cultura Pellet
- Cultura de células e colheita
- ASC Culture (P2-P3; ver Lista de Materiais) em modificação Médio-baixo teor de glucose de Eagle da Dulbecco (DMEM-LG) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2.
- Quand....
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Resultados
gravidade centrífuga induz a superexpressão de marcadores de diferenciação condrogênicas em células-tronco derivadas de tecido adiposo.
Para determinar o grau de força da gravidade centrífuga que é adequado para induzir a diferenciação condrogénica, ASC foram estimuladas com diferentes graus de CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) durante 15 min. Após a estimulação, as ASC foram re-semeadas em placas de cultura e cultivadas duran.......
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Discussão
O estado stemness de células é muito importante para a superexpressão induzida por CG de SOX9. Em nosso estudo, a expressão SOX9 poderia ser induzida por CG na ASC cedo-passagem (2-3), mas não no ASC depois-passagem. Tem sido relatado que, durante o cultivo, ASC conter células CD34 + 3 até 16 passagens. ASC tendem a perder a expressão de CD34 como as células são passadas, resultando em uma baixa resposta de CG.
Com força da gravidade centrífugo, a pressão hidrostática.......
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Divulgações
Declaramos que não temos conflitos de interesse associados a este trabalho.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por uma doação do Projeto de P&D de Tecnologia de Saúde da Coreia por meio do Instituto de Desenvolvimento da Indústria de Saúde da Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar da República da Coreia (número da concessão: HI14C2116) e pelo Fundo de Pesquisa do Hospital St. Mary's de Seul, Universidade Católica da Coreia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Plasticware | |||
| 100 mm Prato | TPP | 93100 | |
| 60 mm Prato | TPP | 93060 | |
| 50 mL Tubo Cornical | SPL | 50050 | |
| 15 mL Tubo Cornical | SPL | 50015 | |
| 10 mL Pipeta Descartável | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Pipeta Descartável | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Baixa glicose | Life Technologies | 11885-084 | meio de base de crescimento |
| Penicilina Estreptomicina | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine | Serum Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | condrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexametasona | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilina Estreptomicina | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Soro Bovino Fetal | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbato-2-fosfato | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μ g/mL |
| L-prolina | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μ g/mL |
| ITS | BD | 1% | |
| TGF&beta humano; 1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materiais | |||
| 18 mm Vidro de cobertura | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Inovação | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| de Vetor | Albumina de Soro Bovino | SP-5050 | |
| Anti-Colágeno II | anticorpo abcam | ab34712 | 1:100 |
| Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) de cabra, Alexa Sonda molecular conjugada Fluor 594 | A-11037 | 1:200 | |
| DAPI | Sonda molecular | D1306 | |
| Prolongar o reagente antidesbotamento de ouro | Invitrogen | P36934 | |
| Vidro de corrediça, revestido | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Clorofórmio | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Etanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polimerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| estrela de carregamento | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) marcador de escada de DNA | Enzynomics | DM003 | |
| Células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (ASCs) | Células |
Referências
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al.
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Reimpressões e permissões
