Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.
Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to “operational taxonomic units”; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage.
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.
Metagenomics er den direkte analyse af DNA oprenset fra biologiske samfund findes inden miljøprøver 1 og blev oprindeligt anvendt til at detektere unculturable bakterier, der findes i sedimenter 2. Metagenomics har været meget anvendt i en række applikationer, såsom at identificere den menneskelige microbiome 3, klassificering mikrobielle populationer i havet 4 og selv for analysen af de bakterielle samfund, der udvikler på kaffemaskiner 5. Indførelsen af næste generation sekventering teknologi resulteret i større sekventering gennemløb og output. Derfor har DNA-sekventering blevet mere økonomisk 6 og dybden af sekventering der kan udføres steget kraftigt, så metagenomics at blive en kraftfuld, analytisk værktøj.
"Front-end" forbedringer i det praktiske, molekylær aspekt af metagenomisk sekventering har drevet væksten i isilico bioinformatiske værktøjer til rådighed for den taksonomiske klassifikation 7-9, funktionel annotation 10,11 og visuel repræsentation 12,13 DNA sekvens data. Det stigende antal tilgængelige, sekventeret prokaryote og eukaryote 14 genomer tillader yderligere nøjagtighed i klassificeringen af mikrobielle samfund, som altid udføres mod en "back-end" reference database over sekventerede genomer 15. kan vedtages to vigtigste tilgange til metagenomisk analyse.
Den mere konventionelle metode er analyse af 16S rRNA-genet kodende region af bakterielle genom. 16S rRNA er stærkt konserveret mellem prokaryote arter, men udviser ni hyper-variable regioner (V1 – V9), som kan udnyttes til identifikation art 16. Indførelsen af længere sekventering (≤ 300 bp parret ende) tilladt til analyse af DNA-sekvenser, der spænder over to hyper-variable regioner, isærV3 – V4 område 17. Fremskridt i andre sekventering teknologier, såsom Oxford nanopore 18 og PacBIO 19, tillader hele 16S rRNA-genet skal sekventeret sammenhængende.
Mens 16S rDNA baserede biblioteker tilvejebringe målrettet med identifikation af arter og muliggøre detektion af lavt kopital DNA, der forekommer naturligt inden oprensede prøver, shotgun sekventering biblioteker kan påvises over arter, der kan indeholde DNA-regioner, der enten ikke amplificerbare af 16S rRNA markør primersekvenser anvendes, eller fordi forskellene mellem templatesekvensen og forstærkningsorganet primersekvensen er for store 20,21. Selv DNA-polymeraser har en high fidelity af DNA-replikation, base-fejl kan alligevel forekomme under PCR-amplifikation og disse indarbejdet fejl kan resultere i fejlagtig klassificering af arter 22 oprindelse. Bias i PCR-amplifikation af template sequences kan også forekomme; sekvenser af DNA med et højt GC-indhold kan være underrepræsenteret i den endelige amplicon pool 23 og tilsvarende unaturlige basemodifikationer, såsom thymin glycol, kan standse DNA-polymeraser bevirker svigt i amplifikation af DNA-sekvenser 24. Derimod kan et haglgevær sekventering DNA-bibliotek er et DNA-bibliotek, der er blevet fremstillet ved hjælp af alle af de oprensede DNA, der er blevet ekstraheret fra en prøve og efterfølgende fragmenteret i kortere DNA kædelængder før forberedelse til sekventering. Klassifikation, af DNA-sekvenser genereret af shotgun-sekventering er mere præcis i forhold til 16S rRNA amplicon sekventering 25, selv om den finansielle omkostninger, der kræves for at nå en pålidelig sekventering dybde er større end den for amplikon sekventering 26. Den største fordel ved shotgun sekventering metagenomics er, at sekvenserede regioner af de forskellige genomer i prøven er tilgængelige for gen efterforskning, når de har væreter blevet taksonomisk klassificeret 27.
Metagenomisk sekvens data analyseres ved en stadig stigende udvalg af bioinformatiske værktøjer. Disse værktøjer er i stand til at udføre en bred vifte af applikationer, for eksempel, kvalitetskontrol analyse af de rå sekvensdata 28, overlappende af parret ende læser 29, de novo samling af sekvens læser til contig'er og stilladser 30,31, taksonomisk klassifikation og visualisering af sekvens læser og samles sekvenser 7,12,32,33 og den funktionelle annotation af samlede sekvenser 34,35.
Ensilage, produceret af landmænd i hele verden fra fermenterede korn såsom majs (Zea mays), der overvejende bruges som kvægfoder. Ensilage behandles med bakterien Lactobacillus sp. at hjælpe gæring 36, men til dato, der er begrænset viden om de andre mikrobielle populationer findes i ensilage. Den fermentation proces kan føre til uønskede og potentielt skadelige mikroorganismer bliver udbredt i ensilagen 37. Foruden gær og skimmelsvampe, bakterier er særligt tilpasses til det anaerobe miljø i gærende ensilage og er hyppigere forbundet med sygdomme hos husdyr snarere end nedbrydningen af ensilagen 38. Smørsyre bakterier kan uforvarende tilføjet fra jorden forbliver ved påfyldning af ensilage siloer og er i stand til at omdanne mælkesyre, et produkt fra anaerob udrådning, at smørsyre, hvilket øger pH i ensilagen 39. Denne stigning i pH kan føre til en stigning i fordærvende bakterier, der normalt ville være i stand til at opretholde væksten under optimal ensilage fermenteringsbetingelser 38. Clostridium spp. , Listeria spp. og Bacillus spp. er af særlig bekymring, især i ensilage til malkekvæg foder, som bakteriesporer, der har overlevet den Gastrointestinal tarmkanalen 40 kan komme ind i fødekæden, føre til mad fordærv og, i sjældne tilfælde, at dyr og mennesker dødsfald 37,39,41-44. Selv om det er vanskeligt at vurdere den nøjagtige økonomiske konsekvenser af dyrlægebehandling og husdyr tab som følge af ensilage fordærv, er det sandsynligt, at være til skade for en gård, hvis et udbrud var at forekomme.
Det antages, at vi ved hjælp af en metagenomisk tilgang kan klassificere mikrobielle populationer, der er til stede i ensilage prøver og desuden identificere mikrobielle samfund forbundet med ensilage fordærv, der ville til gengæld potentielt have en skadelig virkning på husdyr, så afhjælpende foranstaltninger for at være taget før ensilagen skal anvendes som fødekilde.
Mens en in silico analyse kan give en fremragende indsigt til den mikrobielle samfund, der er til stede i miljøprøver, er det afgørende, at de taksonomiske klassificeringer demonstrerede udføres sammen med relevante kontroller, og at en passende dybde af sekventering er blevet opnået til at fange hele befolkning nuværende 51.
Med enhver beregningsanalyse, der er mange veje til at opnå en lignende mål. De metoder, som vi har anvendt i denne undersøgelse, er eksempler på egnede og ligefremme metoder, der er blevet bragt sammen for at opnå en række analyser på ensilagen microbiome. En sort og en stadigt stigende antal bioinformatiske værktøjer og teknikker er til rådighed til at analysere metagenomisk data, for eksempel Phylosift 8 og MetaPhlAn2 52, og disse virkninger skal vurderes, inden undersøgelsen for deres relevans til prøven og analysen reqgendannes for 53. Metagenomisk analysemetoder er begrænset af databaserne for rådighed for klassificering, sekventering dybde og kvaliteten af sekventering.
Den bioinformatiske behandling demonstreret her blev udført på en lokal, høj drevet maskine; dog cloud-baserede systemer er også tilgængelige. Disse cloud-baserede tjenester giver for leje af den nødvendige regnekraft uden at have den høje omkostninger investering af en egnet stærk lokal arbejdsstation. En potentiel anvendelse af denne metode ville være at vurdere ensilage før dens anvendelse i landbruget for at sikre, at ingen potentielt skadelige bakterier er til stede derfor forhindrer dem i at komme ind i fødekæden.
The authors have nothing to disclose.
Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).
FastDNA SPIN Kit for Soil | MP Bio | 116560200 | DNA Extraction |
DNA FastPrep | MP Bio | 116004500 | DNA Extraction |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA Purification |
Elution Buffer | Qiagen | 19806 | DNA Purification |
Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | DNA Quantification |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | DNA Quantification |
Nextera XT DNA Library Prep Kit | Illumina | FC-131-1024 | Library Preparation |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Library Preparation |
TapeStation 2200 | Agilent | G2964AA | DNA Quantification |
HS D100 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA Quantification |
HS D100 ScreenTape Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA Quantification |
TapeStation Tips | Agilent | 5067-5153 | DNA Quantification |
TapeStation Tubes | Agilent | 401428 and 401425 | DNA Quantification |
HiSeq 2500 | Illumina | DNA Sequencing – provided by a sequencing service | |
High Power Analysis Workstation | Various | Local or cloud based, user preferred system |