Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.
Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to “operational taxonomic units”; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage.
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.
Metagenomikk er den direkte analyse av DNA renset fra biologiske samfunn innenfor miljøprøver 1 og ble opprinnelig brukt til å oppdage unculturable bakterier som finnes i sedimenter 2. Metagenomikk har vært mye brukt for en rekke programmer, for eksempel identifisering av den menneskelige mikrobiomer 3, klassifisering mikrobielle populasjoner i havet 4 og selv for analyse av bakteriesamfunn som utvikler på kaffemaskiner 5. Innføringen av neste generasjons sekvense teknologi ført til større sekvense gjennomstrømming og resultat. Følgelig har DNA-sekvensering blir mer økonomisk 6 og dybden av sekvensering som kan utføres har sterkt øket, slik at metagenomikk til å bli en kraftig, analytisk verktøy.
"Front-end" forbedringer i det praktiske, molekylære aspekter av metagenomic sekvense har drevet veksten av isilico bioinformatikk verktøy tilgjengelig for taksonomisk klassifisering 7-9, funksjonell annotering 10,11 og visuell representasjon 12,13 av DNA sekvensdata. Det økende antall tilgjengelige, sekvensert prokaryote og eukaryote 14 genomer gir ytterligere nøyaktighet i klassifiseringen av mikrobielle samfunn, som alltid utføres mot en "back-end" referansedatabase for sekvensert genomene 15. To hovedtilnærminger kan bli vedtatt for metagenomic analyse.
Den mer konvensjonelle metoden er analyse av 16S rRNA-genet kodende region av bakterielt genom. 16S rRNA er sterkt konservert mellom prokaryote arter, men viser ni hyper-variable regioner (V1 – V9) som kan utnyttes for artsbestemmelse 16. Innføringen av lengre sekvensering (≤ 300 bp sammenkoblet ende) er tillatt for analyse av DNA-sekvenser som strekker seg over to hypervariable regioner, i særdeleshetV3 – V4 region 17. Fremskritt i andre sekvense teknologier, for eksempel Oxford nanopore 18 og PacBIO 19, tillater hele 16S rRNA-genet for å bli sekvensert contiguously.
Mens 16S rDNA-baserte biblioteker tilveiebringe en målrettet tilnærming til artsidentifikasjon og muliggjøre påvisning av lave kopitall DNA som naturlig forekommer i løpet av rensede prøver, hagle sekvense biblioteker tillate påvisning av arter som kan inneholde DNA-områder som er enten ikke forøkbare av 16S rRNA markør primersekvensene anvendt, eller fordi forskjellene mellom malen-sekvensen og den forsterkende primer-sekvensen er for store 20,21. Videre, selv om DNA-polymeraser har en høy fidelity av DNA replikasjon, base feil kan likevel oppstå under PCR forsterkning og disse innlemmet feil kan føre til feilklassifisering av opprinnelsesarter 22. Skjevheter i PCR-amplifisering av malen sequences kan også oppstå; sekvenser av DNA med et høyt GC-innhold kan være under representert i den endelige amplikonet bassenget 23 og likeledes unaturlige Basemodifikasjoner, såsom tymin glykol, kan stoppe DNA-polymeraser som forårsaker svikt i amplifikasjonen av DNA-sekvenser 24. I motsetning til dette, er et DNA-bibliotek som har blitt fremstilt ved hjelp av alle de rensede DNA som er ekstrahert fra en prøve og deretter fragmentert i kortere DNA-kjedelengder før forberedelse for sekvense en hagle sekvensering DNA-bibliotek. Taksonomisk klassifisering av DNA-sekvenser som er generert av hagle sekvensering blir mer nøyaktig i forhold til 16S rRNA amplikonet sekvensering 25, selv om den økonomiske kostnader som kreves for å oppnå en pålitelig sekvense dybde er større enn den til amplikonet sekvense 26. Den store fordelen med hagle sekvense metagenomikk er at sekvensert regioner i de ulike genomer i utvalget er tilgjengelige for genet prospektering når de har værthar blitt taksonomisk klassifisert 27.
Metagenomic sekvens data er analysert av en stadig økende utvalg av bioinformatiske verktøy. Disse verktøyene er i stand til å utføre en rekke forskjellige anvendelser, for eksempel, kvalitetskontroll analyse av rå sekvensdata 28, overlapp av parede ende leser 29, de novo montering av sekvensavlesning for å contigs og stillaser 30,31, taksonomisk klassifisering og visualisering av sekvensen leser og sammensatte sekvenser 7,12,32,33 og funksjonell annotering av sammensatte sekvenser 34,35.
Silo, produsert av bønder over hele verden fra gjæret korn som mais (Zea mays), blir hovedsakelig brukt som dyrefôr. Silofor behandlet med bakterien Lactobacillus sp. å hjelpe gjæring 36, men til dags dato, er det begrenset kunnskap om de andre mikrobielle populasjoner funnet i silo. den fermentation prosessen kan føre til uønskede og potensielt skadelige mikroorganismer blir utbredt i ensilasje 37. I tillegg til gjær og mugg, bakterier er spesielt tilpasses for anaerobt miljø i fermen silofor, og er mer hyppig assosiert med sykdommer i husdyr i stedet for nedbrytning av ensilasje 38. Smørsyrebakterier kan utilsiktet tilsettes fra jord forblir ved fylling av silo siloer og er i stand til å omdanne melkesyre, et produkt av anaerob nedbrytning, til smørsyre, og dermed øke pH-verdien i ensilasje 39. Denne økningen i pH kan føre til et oppsving i kvalitetsforringende bakterier som normalt vil være ute av stand til å opprettholde vekst under optimale ensileringsmidler gjæringsforhold 38. Clostridium spp. , Listeria spp. og Bacillus spp. er av spesiell bekymring, særlig i surfôr for melkekyr fôr, som bakteriesporer som har overlevd Gastrointestinal kanalen 40 kan komme inn i næringskjeden, føre til mat forringende og, i sjeldne tilfeller, til dyr og mennesker dødsfall 37,39,41-44. Videre, mens det er vanskelig å anslå nøyaktig økonomiske konsekvensene av veterinærbehandling og husdyr tap forårsaket av surfôr forringende, er det sannsynlig å være skadelig for en gård om et utbrudd skulle oppstå.
Det er en hypotese at ved å bruke en metagenomic tilnærming kan vi klassifisere de mikrobielle populasjoner som er tilstede i siloprøver og videre identifisere mikrobielle samfunn forbundet med surfôr forringende som ville i sin tur potensielt ha en skadelig effekt på husdyr, slik at hjelpetiltak skal være tatt før ensilasje skal brukes som en matkilde.
Mens en i silico analyse kan gi en god innsikt til de mikrobielle samfunn som er til stede i miljøprøver, er det viktig at de taksonomiske klassifisering demonstrert bli utført i forbindelse med relevante kontrollene, og at en passende dybde av sekvensering er oppnådd for å fange hele befolkning til stede 51.
Med noen matematisk analyse, er det mange ruter for å oppnå et lignende mål. Metodene som vi har brukt i denne studien er eksempler på egnede og enkle metoder, som har blitt brakt sammen for å oppnå en rekke analyser på surfôr mikrobiomer. En variasjon og et stadig økende antall bioinformatikk verktøy og teknikker er tilgjengelige for å analysere metagenomic data, for eksempel Phylosift 8 og MetaPhlAn2 52, og disse bør vurderes før etterforskningen for sin relevans til prøven og analysen required 53. Metagenomic analysemetoder er begrenset av databaser for tilgjengelige for klassifisering, sekvensering dybden og kvaliteten av sekvensering.
Den bioinformatiske behandlingen demonstrert her ble utført på en lokal, høy drevet maskin; Men cloud-baserte systemer er også tilgjengelig. Disse nettskybaserte tjenester gir mulighet for leie av nødvendig datakraft uten å ha høye kostnader investering på en passende kraftig lokal arbeidsstasjon. En potensiell anvendelse av denne metode ville være å vurdere silo før dets anvendelse i jordbruket for å sikre at ingen potensielt skadelige bakterier er til stede og således hindre dem fra å komme inn i næringskjeden.
The authors have nothing to disclose.
Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).
FastDNA SPIN Kit for Soil | MP Bio | 116560200 | DNA Extraction |
DNA FastPrep | MP Bio | 116004500 | DNA Extraction |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA Purification |
Elution Buffer | Qiagen | 19806 | DNA Purification |
Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | DNA Quantification |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | DNA Quantification |
Nextera XT DNA Library Prep Kit | Illumina | FC-131-1024 | Library Preparation |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Library Preparation |
TapeStation 2200 | Agilent | G2964AA | DNA Quantification |
HS D100 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA Quantification |
HS D100 ScreenTape Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA Quantification |
TapeStation Tips | Agilent | 5067-5153 | DNA Quantification |
TapeStation Tubes | Agilent | 401428 and 401425 | DNA Quantification |
HiSeq 2500 | Illumina | DNA Sequencing – provided by a sequencing service | |
High Power Analysis Workstation | Various | Local or cloud based, user preferred system |