Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em> In Vitro</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
Estudos de proteínas de membrana integrais in vitro são frequentemente complicada pela presença de um domínio transmembranar hidrófobo. complicando ainda mais estes estudos, a reincorporação de proteínas de membrana de detergente-solubilizado em lipossomas é um processo estocástico, onde topologia proteína é impossível de aplicar. Este documento apresenta um método alternativo para estas técnicas difíceis que utiliza uma estrutura de suporte à base de lipossomas. a solubilidade da proteína é aumentada pela supressão do domínio transmembranar, e estes aminoácidos são substituídos com um radical amarrar, tal como uma cauda de His. Este tirante interage com um grupo de ancoragem (Ni2 + coordenado por ácido nitrilotriacético (NTA (Ni 2+)) para proteínas marcadas com His), que executa uma topologia uniforme de proteína na superfície do lipossoma. Um exemplo é apresentado, em que a interacção entre a proteína relacionada com um dinamina (Drp1) com uma proteína de membrana integral, Cisão do Factor mitocondrial (QFP), foi investigated usando este método scaffold lipossoma. Neste trabalho, nós demonstramos a capacidade de recrutar Mff eficientemente Drp1 solúvel à superfície dos lipossomas, o que estimulou a sua actividade de GTPase. Além disso, foi capaz de Drp1 tubulate o modelo lípido Mff-decorado na presença de lípidos específicos. Este exemplo demonstra a eficácia de lipossomas de andaime usando ensaios estruturais e funcionais e destaca o papel do QFP, a regulação da actividade Drp1.
Introduction
Estudando interações proteína-proteína de membrana-proximal é uma tarefa desafiadora devido à dificuldade de recapitular o ambiente nativo das proteínas de membrana integrais envolvidas 1. Isto é devido à necessidade de solubilização detergente e a orientação inconsistente de proteínas em proteolipossomas. A fim de evitar estes problemas, que têm empregue uma estratégia em que os domínios solúveis de proteínas de membrana integrais são expressos como proteínas de fusão His-tag, e estes fragmentos solúveis estão ancoradas aos lipossomas através de interacções de andaime com NTA (Ni 2+) headgroups no lípido superfície. Usando estes andaimes, as interacções proteína-lipídicos proximal pode ser investigada através de uma gama de composições de lípidos e proteínas.
Temos eficazmente aplicado esse método para investigar as interacções proteína-proteína crítica que governam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e examinar interacções lípidos que modulam este processo 2. Durante fissão mitocondrial, uma proteína de remodelação da membrana conservada, chamada proteína relacionada com dinamina 1 (Drp1) 3, é recrutado para a superfície do mitocondrial externa da membrana (OMM) em resposta a sinais celulares que regulam a homeostase de energia, sinalização apoptótica, e vários outros processos mitocondriais integral. Esta grande GTPase, citosólica é recrutada para a superfície das mitocôndrias através de interacções com proteínas integrais OMM 4 – 8. O papel de uma tal proteína, Cisão do Factor mitocondrial (QFP), tem sido difícil para elucidar devido a uma interacção fraca aparente com Drp1 in vitro. No entanto, estudos genéticos demonstraram claramente que Mff é essencial para o êxito da fissão 7,8 mitocondrial. O método descrito neste manuscrito foi capaz de superar as deficiências anteriores, introduzindo interações lipídicas simultâneas que promovem interações Drp1-QFP. No geral, este romance REVEA ensaiolevou interações fundamentais que orientam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e forneceu uma nova etapa para estudos estruturais e funcionais em curso desta máquina molecular essencial.
Até à data, a análise de interacções entre Drp1 e Mff ter sido complicada pela flexibilidade inerente do Mff 9, a heterogeneidade dos polímeros Drp1 2,10, e a dificuldade de purificação e a reconstituição de comprimento completo Mff com um domínio transmembranar de 11 intacta. Nós abordado esses desafios usando lipossomas NTA (Ni 2+) de andaime para reconstituir marcada com His Mff faltando seu domínio transmembranar (MffΔTM-His 6). Esta estratégia foi vantajoso porque MffΔTM foi extremamente solúvel quando sobre-expresso em E. coli, e esta proteína foi isolado facilmente reconstituída em lipossomas de andaime. Quando preso a estes modelos de lípidos, Mff assumido um, voltados para o exterior orientação idêntica na superfície da membrana.Além destas vantagens, lípidos mitocondriais, tais como a cardiolipina, foram adicionados para estabilizar Mff dobragem e de associação com a membrana 11. A cardiolipina também interage com o domínio variável de 2,12 Drp1 que podem estabilizar esta região desordenada e facilitar a montagem da máquina de fissão.
Este método robusto é amplamente aplicável para futuros estudos que visam avaliar as interações proteína de membrana-proximal. Através do uso de interacções amarrar / afinidade adicionais, a sofisticação destes estudos de reconstituição da membrana pode ser aumentada para imitar complexidade adicional encontrado na superfície das membranas dentro das células. Ao mesmo tempo, as composições de lípidos podem ser modificados para mimetizar mais precisamente os ambientes nativas destes complexos macromoleculares. Em resumo, este método proporciona um meio para examinar as contribuições relativas de proteínas e lípidos em moldar a morfologias de membrana durante Proc celulares críticascessos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo oferece um método para a investigação das interacções proteína-proteína envolvendo proteínas de membrana integrais. Através da utilização de um lipossoma andaime modular, os investigadores são capazes de avaliar a actividade de uma ou mais proteínas num ambiente de lípido-proximal. Estudos anteriores têm demonstrado um método semelhante por enzimas de receptor da membrana do plasma 24-26. Nós expandimos esse método para incorporar cofatores lipídicos e e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
Referências
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