Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em> In vitro</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
Des études sur les protéines membranaires intégrales in vitro sont souvent compliquées par la présence d'un domaine transmembranaire hydrophobe. Pour compliquer encore ces études, réincorporation des protéines membranaires détergent solubilisé dans des liposomes est un processus stochastique où la protéine topologie est impossible à appliquer. Cet article propose une méthode alternative à ces techniques difficiles qui utilise un échafaudage à base de liposomes. La solubilité des protéines est améliorée par deletion du domaine transmembranaire et les acides aminés sont remplacés par un fragment d'attache, telle qu'une étiquette His. Cette attache coopérant avec un groupe d' ancrage (Ni 2+ coordonné par l' acide nitrilotriacétique (NTA (Ni 2+)) pour les protéines à marquage His), qui applique une topologie de protéine homogène à la surface du liposome. Un exemple est présenté dans lequel l'interaction entre la protéine apparentée à Dynamin-1 (DRP1) avec une protéine membranaire intégrale, le facteur mitochondrial Fission (MFF) est investigated utilisant cette méthode échafaudage liposome. Dans ce travail, nous avons démontré la capacité de MFF de recruter efficacement DRP1 soluble à la surface des liposomes, ce qui a stimulé son activité GTPase. En outre, DRP1 a pu tubulé le modèle lipidique MFF-décoré en présence de lipides spécifiques. Cet exemple démontre l'efficacité des liposomes d'échafaudage en utilisant des analyses structurales et fonctionnelles et met en évidence le rôle de la CFP dans la régulation de l'activité DRP1.
Introduction
L' étude des interactions protéine-protéine membrane proximal est une entreprise difficile en raison de la difficulté à récapitulant l'environnement natif des protéines membranaires intégrales impliquées 1. Ceci est dû à la nécessité de solubilisation avec un détergent et de l'orientation non uniforme des protéines dans des protéoliposomes. Afin d'éviter ces problèmes, nous avons utilisé une stratégie selon laquelle les domaines solubles de protéines membranaires intégrales sont exprimés sous forme de protéines de fusion His-tag, et ces fragments solubles sont ancrés à des liposomes de l' échafaudage par des interactions avec le NTA (Ni 2+) , les groupes de tête au lipide surface. L'utilisation de ces échafauds, les interactions entre protéines lipides proximal peuvent être étudiés sur une gamme de compositions de lipides et de protéines.
Nous avons effectivement appliqué cette méthode pour étudier les interactions protéine-protéine critiques qui régissent l'assemblage du complexe de fission mitochondriale et examiner les interactions lipidiques qui modulent cette processus 2. Lors de la fission mitochondriale, une protéine de remodelage de la membrane conservée, appelée protéine apparentée Dynamin-1 (DRP1) 3, est recruté à la surface de la mitochondriale externe membrane (OMM) en réponse à des signaux cellulaires qui régulent l' homéostasie énergétique, la signalisation apoptotique, et plusieurs autres processus mitochondriales intégrés. Cette grande GTPase cytosolique est recruté à la surface des mitochondries par des interactions avec les protéines intégrales OMM 4 – 8. Le rôle d'une telle protéine, mitochondriale Fission Factor (MFF), a été difficile à élucider en raison d'une faible interaction apparente avec DRP1 in vitro. Néanmoins, les études génétiques ont clairement démontré que MFF est essentiel pour le succès de mitochondrial fission 7,8. La méthode décrite dans ce manuscrit a été en mesure de remédier aux lacunes précédentes en introduisant des interactions lipidiques simultanées qui favorisent les interactions DRP1-MFF. Dans l'ensemble, ce nouveau test REVEAconduit les interactions fondamentales guidant l'assemblage du complexe de fission mitochondriale et a fourni une nouvelle étape pour les études structurales et fonctionnelles en cours de cette machine moléculaire essentielle.
À ce jour, l' examen des interactions entre DRP1 et MFF ont été compliquées par la flexibilité inhérente du MFF 9, l'hétérogénéité des DRP1 Polymères 2,10, et la difficulté de la purification et la reconstitution pleine longueur MFF avec un domaine transmembranaire intact 11. Nous avons abordé ces défis en utilisant des liposomes NTA (Ni 2+) d'échafaudage pour reconstituer His-tagged MFF dépourvu de son domaine transmembranaire (MffΔTM-His 6). Cette stratégie a été avantageuse car MffΔTM était extrêmement soluble lorsque surexprimé dans E. coli, et cette protéine isolée a été facilement reconstituées sur des liposomes d'échafaudage. Quand attaché à ces modèles de lipides, MFF suppose un traitement identique, l'orientation tournée vers l'extérieur sur la surface de la membrane.En plus de ces avantages, les lipides mitochondriales, tels que la cardiolipine, ont été ajoutés pour stabiliser MFF pliage et son association avec la membrane 11. Cardiolipine interagit également avec le domaine variable de 2,12 DRP1 qui peut stabiliser cette région désordonnée et faciliter l' assemblage du mécanisme de fission.
Cette méthode robuste est largement applicable pour les futures études visant à évaluer les interactions entre protéines membranaires-proximal. Grâce à l'utilisation des interactions tethering / d'affinité supplémentaires, la sophistication de ces études de reconstitution de la membrane peut être améliorée pour imiter la complexité supplémentaire trouvée à la surface des membranes dans les cellules. Dans le même temps, les compositions lipidiques peuvent être modifiées pour mimer plus précisément les environnements d'origine de ces complexes macromoléculaires. En résumé, cette méthode fournit un moyen d'examiner les contributions relatives des protéines et des lipides dans la formation de morphologies membranaires au cours de proc cellulaire critiqueesses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole offre une méthode pour l'étude des interactions protéine-protéine impliquant des protéines membranaires intégrales. En utilisant un liposome échafaudage modulaire, les chercheurs sont capables d'évaluer l'activité d'une ou plusieurs protéines dans un environnement lipidique proximale. Des études antérieures ont démontré un procédé similaire pour les enzymes des récepteurs de la membrane plasmatique 24-26. Nous avons élargi cette méthode pou…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
Referências
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