Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.
The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.
Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम है कि अनुभव से पहचान की गई है चर्चा कर रहे हैं। सिरिंज घुसपैठ करके, पेप्टाइड आधारित योगों रंध्र के माध्यम से संयंत्र पत्ती के अंदर airspaces में पेश कर रहे हैं। समाधान के लिए अधिक से अधिक तेज सुनिश्चित करने के लिए, घुसपैठ प्रक्रिया से बाहर किया जाना चाहिए जब पौधों को पर्याप्त पानी के साथ और प्रकाश की अवधि के दौरान प्रदान की स्थिति है कि रंध्र उद्घाटन अर्थात्। के लिए अनुकूल हैं, के तहत कर रहे हैं। साथ अभिकर्मक परिसरों की तैयारी करने का संबंध है, योगों कि दो पेप्टाइड्स (mitochondrial डीएनए-लक्षित वितरण के लिए) का एक संयोजन शामिल करने के लिए, प्रत्येक घटक के अलावा के लिए अनुक्रम महत्वपूर्ण है और उल्टे नहीं किया जाना चाहिए।
वहाँ प्रक्रिया के लिए कई प्रशंसनीय संशोधन कर रहे हैं। संयंत्र कोशिकाओं की घुसपैठ के लिए एक अन्य विकल्प वैक्यूम घुसपैठ का उपयोग करते हैं, जो पूरे पौधों और / या आंशिक सहित ऊतकों में जटिल समाधान पेश करने में सक्षम हैशिखर मेरिस्टेमों। इस वैकल्पिक प्रक्रिया के लिए, पौध अभिकर्मक समाधान में डूबे हुए हैं, और वैक्यूम से उत्पन्न दबाव के आधार पर, पेप्टाइड कार्गो कॉम्प्लेक्स रंध्र के माध्यम से और संयंत्र कोशिकाओं (Yoshizumi, टी, अप्रकाशित डेटा) के लिए मजबूर कर रहे हैं।
क्षणिक जीन अभिव्यक्ति, पशु कोशिकाओं का उपयोग अध्ययन के आधार पर, उच्च सांद्रता डीएनए 29-31 के साथ बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। यह (चित्रा 4), अभिकर्मक दक्षता प्रभावित करती है जो ध्यान दें कि डीएनए के लिए पेप्टाइड के अनुपात परिसरों की biophysical गुण (आकार, सतह प्रभार) को प्रभावित करता है महत्वपूर्ण है; इसलिए, इष्टतम अनुपात भी वृद्धि हुई डीएनए एकाग्रता के साथ बनाए रखा जाना चाहिए।
एक जीन / प्रोटीन वितरण एजेंट के रूप में पेप्टाइड्स का उपयोग करने में मुख्य लाभ में से एक यह है कि इसकी अनुक्रम एक वांछित कार्य को पूरा करने के लिए ट्यूनिंग करने के लिए उत्तरदायी है। उदाहरण के लिए, वाहक पेप्टाइड की mitochondrial लक्षित डोमेन इस संवर्धन में वर्णितY इन अंगों को स्थानीयकरण के लिए chloroplastic या peroxisomal-लक्ष्य दृश्यों के साथ बदला जा सकता है। जबकि क्लोरोप्लास्ट परिवर्तन biolistics 32-34 का उपयोग कर कई पौधों में संभव है, न है और न ही एग्रोबैक्टीरियम biolistic विधि माइटोकॉन्ड्रिया या अन्य अंगों नाभिक (तालिका 2) इसके अलावा में जीन मिलवा सकता है।
वहाँ पेप्टाइड आधारित अभिकर्मक के लिए कोई कठोर मेजबान दूरी की सीमाओं, एग्रोबैक्टीरियम आधारित विधि (तालिका 2) के विपरीत हैं। अब तक, ए thaliana, एन benthamiana और चिनार के अभिकर्मक के लिए योगों अनुकूलित किया गया है (तालिका 1), लेकिन विधि भी निकोटियाना Tabacum के लिए आवेदन किया जा सकता है, टमाटर फसल माइक्रो-टॉम, चावल (प्रारंभिक प्रयोगों के आधार पर), और अन्य मोनो और द्विबीजपत्री पौधों।
अभी तक के रूप में, वहाँ ट्रांस्जीन आकार में कोई ज्ञात सीमा है जब पेप्टाइड्स एक इस्तेमाल कर रहे हैंएस अभिकर्मक वैक्टर। इसके विपरीत, बड़े डीएनए अणु एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता तरीकों 35,36 के परिवर्तन दक्षता, और लगभग 200 केबी के ट्रांसजीन 37-39 सूचित किया गया है के लिए एक ऊपरी आकार की सीमा कम करने के लिए पाया गया है। Biolistics का उपयोग करना, दूसरे हाथ पर, बड़े डीएनए टुकड़े तैयारी या पौधों में 38 प्रसव के दौरान sheared जा सकता है। हालांकि कोई ऊपरी सीमा अब तक biolistic परिवर्तन के लिए निर्धारित किया गया है, शारीरिक constrains डीएनए कि बहुत कम से कम 150 केबी 40 को हस्तांतरित किया जा सकता है के आकार को सीमित करने के लिए पाया गया है। या तो एग्रोबैक्टीरियम या microprojectile बमबारी रोजगार मौजूदा दृष्टिकोण, ऊपर चर्चा की तुलना में जीन स्थानांतरण के लिए पेप्टाइड आधारित प्रणाली का उपयोग करने का प्रमुख लाभ, 2 टेबल में संक्षेप हैं।
कुछ सीमाएँ इस विधि के लिए मौजूद हैं के रूप में यह खड़ा है। सबसे पहले, इस तरह के एमआईटी के रूप में विशिष्ट अंगों, को pDNA की डिलीवरी को निशाना बनायाochondria, डीएनए बाध्यकारी, सेल मर्मज्ञ और organelle-पारगमन दृश्यों का एक साधारण संयोजन के द्वारा ही संभव सिद्ध किया गया है, हालांकि दक्षता कम था। ट्रांसजीन अभिव्यक्ति confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है, केवल कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया की एक छोटी सी आबादी में। इसलिए, आगे संशोधन के लिए आवश्यक हैं: (i) सेल / organellar झिल्ली भर में अधिक परिसरों के translocation बढ़ाने, और (ii) हदबंदी और अभिव्यक्ति के लिए लक्ष्य organelle में वाहक पेप्टाइड से pDNA के हस्तांतरण में सुधार होगा। दूसरे, इस डीएनए वितरण प्रणाली का उपयोग कर, बहिर्जात रिपोर्टर जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक कोशिकाओं के साइटोसोलिक और mitochondrial डिब्बे में हासिल की थी। स्थिर समावेश और संयंत्र परमाणु / organellar जीनोम में पेश जीनों की अभिव्यक्ति के लिए अभी तक उपयुक्त चयन रणनीतियों के अभाव की वजह से नहीं स्थापित किया गया है, हालांकि,।
स्वीकार करते हुए वहाँ सुधार या आगे विकास के लिए क्षेत्र हैं किevelopment, पेप्टाइड व्युत्पन्न रणनीति यहाँ वर्णित एक सरल और बहुमुखी तकनीक है कि विभिन्न कार्गो के वितरण विविध संयंत्र प्रकार में के लिए मार्ग प्रशस्त किया है बनी हुई है।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों उन्नत प्रौद्योगिकी के लिए जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी खोजपूर्ण रिसर्च (JST-ERATO), नई ऊर्जा और औद्योगिक प्रौद्योगिकी विकास संगठन (एनईडीओ), और क्रॉस-मंत्रालयी सामरिक अभिनव संवर्धन कार्यक्रम (एसआईपी), जापान से धन स्वीकार करना चाहते हैं ।
(KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
(BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
1 mL and 10 mL Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
1.5 mL Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |