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Química

एमिनो एसिड और पेप्टाइड्स अकार्बनिक सामग्री के साथ बातचीत में इनसाइट्स एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग

Published: March 06, 2017
doi:
10.3791/54975
, ,
1Institute of Chemistry and The Center for Nanoscience and Nanotechnology,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत एक परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी (AFM) का उपयोग करते हुए एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप से एक अच्छी तरह से परिभाषित अकार्बनिक सतह और या तो पेप्टाइड या अमीनो एसिड के बीच बातचीत के बल को मापने के लिए। जानकारी के माप से प्राप्त बेहतर पेप्टाइड अकार्बनिक पदार्थ अंतरावस्था समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

Abstract

प्रोटीन या पेप्टाइड्स और अकार्बनिक सामग्री के बीच बातचीत कई दिलचस्प प्रक्रियाओं के लिए सीसा। उदाहरण के लिए, खनिजों के साथ प्रोटीन के संयोजन अद्वितीय गुणों के साथ मिश्रित सामग्री के गठन की ओर जाता है। इसके अलावा, जैव अवरोध की अवांछनीय प्रक्रिया biomolecules, मुख्य रूप से प्रोटीन, सतहों पर सोखना द्वारा शुरू की है। यह कार्बनिक परत बैक्टीरिया के लिए एक आसंजन परत है और उन्हें सतह के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है। मौलिक बलों है कि कार्बनिक अकार्बनिक इंटरफेस में बातचीत शासन को समझना इसलिए अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण है और ऑप्टिकल, यांत्रिक और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए नई सामग्री के डिजाइन करने के लिए ले जा सकता है। यह पत्र एक एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है कि एक AFM का इस्तेमाल या तो पेप्टाइड या अमीनो एसिड और अच्छी तरह से परिभाषित अकार्बनिक सतहों के बीच आसंजन बल को मापने के लिए यह दर्शाता है। इस तकनीक AFM को बायोमोलिक्यूल संलग्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिलएक सहसंयोजक लचीला लिंकर और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोप द्वारा एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के माध्यम से टिप। इसके अलावा, इन मापों के एक विश्लेषण शामिल है।

Introduction

प्रोटीन और अकार्बनिक खनिज के बीच बातचीत के विशिष्ट गुणों के साथ मिश्रित सामग्री के निर्माण की ओर जाता है। इस उच्च यांत्रिक शक्ति या अद्वितीय ऑप्टिकल गुणों के साथ सामग्री भी शामिल है। 1, 2 उदाहरण के लिए, खनिज हाइड्रॉक्सियापटाइट के साथ प्रोटीन कोलेजन के संयोजन विभिन्न functionalities के लिए या तो मुलायम या हार्ड हड्डियों उत्पन्न करता है। 3 कम पेप्टाइड्स भी उच्च विशिष्टता के साथ अकार्बनिक सामग्री बाध्य कर सकते हैं। 4, 5, 6 इन पेप्टाइड्स की विशिष्टता नई चुंबकीय और इलेक्ट्रॉनिक सामग्री डिजाइनिंग, 7, 8, 9 सामग्री nanostructured fabricating बढ़ रही है, क्रिस्टल के लिए इस्तेमाल किया गया है, 10 और synthesizing नैनोकणों। 11 तंत्र पेप्टाइड या प्रोटीन और अकार्बनिक सामग्री के बीच बातचीत अंतर्निहित इसलिए हमें adsorptive गुणों में सुधार के साथ नए मिश्रित सामग्री डिजाइन करने के लिए अनुमति देगा समझना। इसके अलावा, क्योंकि एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ प्रत्यारोपण के अंतरावस्था प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता है, बेहतर अकार्बनिक पदार्थों के साथ प्रोटीन की बातचीत को समझने हमारे प्रत्यारोपण डिजाइन करने की क्षमता में सुधार होगा। एक अन्य महत्वपूर्ण क्षेत्र है कि अकार्बनिक सतहों के साथ बातचीत प्रोटीन शामिल antifouling सामग्री के निर्माण की है। 12, 13, 14, 15 biofouling एक अवांछनीय प्रक्रिया है जिसमें जीवों एक सतह को देते है। यह हमारे जीवन पर कई हानिकारक प्रभाव पड़ता है। उदाहरण के लिए, चिकित्सा उपकरणों पर बैक्टीरिया की जैव अवरोध अस्पताल का अधिग्रहण संक्रमण के लिए होता है। नावों और बड़े जहाजों पर समुद्री जीवों की जैव अवरोध बढ़ जाती है ईंधन की खपत। 12, 16, 17, 18

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (SMFS), एक AFM का उपयोग कर, सीधे एक एमिनो एसिड या एक सब्सट्रेट के साथ एक पेप्टाइड के बीच बातचीत उपाय कर सकते हैं। 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 में इस तरह के फेज प्रदर्शन, 27, 28 के रूप में अन्य तरीकों क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance (QCM) 29 या सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर), 29, 30, 31, 32,रेफरी "> 33 को मापने के लिए थोक में पेप्टाइड्स और अकार्बनिक सतहों के लिए प्रोटीन की बातचीत। 34, 35, 36 इसका मतलब यह है कि इन तरीकों से प्राप्त परिणामों के अणुओं या समुच्चय की टुकड़ियों से संबंधित हैं। SMFS में, एक या बहुत कुछ अणुओं AFM टिप करने के लिए तय कर रहे हैं और वांछित सब्सट्रेट के साथ उनकी बातचीत मापा जाता है। यह दृष्टिकोण सतह से प्रोटीन खींच कर प्रोटीन तह अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। इसके अलावा, यह कोशिकाओं और प्रोटीन और उनके ligands के लिए एंटीबॉडी के बंधन के बीच बातचीत को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 37, 38, 39, 40 इस पत्र में विस्तार से वर्णन silanol रसायन विज्ञान का उपयोग AFM टिप करने के लिए या तो पेप्टाइड या अमीनो एसिड संलग्न करने के लिए कैसे। इसके अलावा, कागज बताते हैं कि कैसे बल माप प्रदर्शन करने के लिए और विश्लेषण करने के लिए कैसेपरिणाम है।

Protocol

1. टिप संशोधन क्रय सिलिकॉन नाइट्राइड (सी 3 N 4) सिलिकॉन सुझावों के साथ AFM cantilevers (~ 2 एनएम के नाममात्र ब्रैकट त्रिज्या)। 20 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल में सूई से प्रत्येक AFM ब्रैकट साफ करें। कमरे के त?…

Representative Results

चित्रा 1 टिप संशोधन प्रक्रिया को दर्शाती है। पहले चरण में, एक प्लाज्मा उपचार सिलिकॉन नाइट्राइड टिप की सतह बदल जाता है। टिप ओह समूहों प्रस्तुत करता है। इन समूहों को तो silanes के साथ प्रति?…

Discussion

कदम 1.3, 1.4 और 1.7 प्रोटोकॉल में व्यापक देखभाल के साथ और एक बहुत ही सौम्य तरीके से बाहर किया जाना चाहिए। 1.3 चरण में, टिप silane मिश्रण और silanization प्रक्रिया माहौल निष्क्रिय (नमी मुक्त) में बाहर किया जाना चाहिए साथ संपर्…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.

Materials

Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips Bruker (Camarilo, CA, USA) MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm 
Methyltriethoxysilane  Acros Organics (New Jersey, USA) For Silaylation of the AFM tip 
3-(Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) Used for tip modification 
Triisopropylsilane Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) Used for tip modification
N-Ethyldiisopropylamine Alfa-Aesar (Lancashire, UK) Used for tip modification
Triethylamine Alfa-Aesar (Lancashire, UK) Used for tip modification
Piperidine Alfa-Aesar (Lancashire, UK) Used for tip modification
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide  (Fmoc-PEG-NHS) Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) Used as the covalent flexible linker  (MW = 5000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Alfa Aser (Heysham, England) Used as a coupling reagent. 
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) Acros Organics (New Jersey, USA) Used as Solvent in Tip modification procedure
DMF (dimethylformamide) Merck (Darmstadt, Germany) Used as Solvent in Tip modification procedure
Trifluoro acetic acid (TFA) Merck (Darmstadt, Germany)
Acetic anhydride Merck (Darmstadt, Germany)
Peptides GL Biochem (Shanghai, China).
Phenylalanine and Tyrosine  Biochem (Darmstadt, Germany) 
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) (30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)
Mica substrates TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) 9.9 mm diameter
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Referências

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Das, P., Duanias-Assaf, T., Reches, M. Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (121), e54975, doi:10.3791/54975 (2017).
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