Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

Jie Xiang; Katie Reding; Leslie Pick

doi:10.3791/54976

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Artigo de método

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

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DOI:

10.3791/54976

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28 de dezembro de 2016

Jie Xiang¹^,² , Katie Reding¹ , Leslie Pick¹^,²

¹Entomology Department, University of Maryland, ²Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Resumo

Os avanços na genômica levantaram a possibilidade de sondar a biodiversidade em uma escala sem precedentes. No entanto, a sequência por si só não será informativa sem ferramentas para estudar a função do gene. O desenvolvimento e compartilhamento de protocolos detalhados para o estabelecimento de novos sistemas modelo em laboratórios e para ferramentas para realizar estudos funcionais é, portanto, crucial para alavancar o poder da genômica. Os coleópteros (besouros) são o maior clado de insetos e ocupam praticamente todos os tipos de habitats do planeta. Além de fornecer modelos ideais para pesquisa fundamental, os estudos de besouros podem ter impactos no controle de pragas, pois muitas vezes são pragas de residências, agricultura e indústrias alimentícias. Protocolos detalhados para criação e manutenção de colônias de laboratório de D. maculatus e para a realização de interferência mediada por dsRNA em D. maculatus são apresentados. Os procedimentos de RNAi embrionário e parental - incluindo configuração do aparelho, preparação, injeção e recuperação pós-injeção - são descritos. Também são apresentados métodos para análise de fenótipos embrionários, incluindo viabilidade, defeitos de padronização em larvas eclodidas e preparações de cutícula para larvas não eclodidas. Esses ensaios, juntamente com a hibridização in situ e a imunocoloração para marcadores moleculares, tornam D. maculatus um sistema modelo acessível para pesquisa básica e aplicada. Eles também fornecem informações úteis para estabelecer procedimentos em outros sistemas de modelos de insetos emergentes.

Introdução

Em 1998, Fire and Mello relatado que o RNA de cadeia dupla (ARNcd) pode induzir a inibição da função do gene em Caenorhabditis elegans ^1. Esta resposta desencadeada por ARNdc foi denominado ARN de interferência (RNAi), e tal silenciamento de genes mediada por ARNi foi relatado para ser conservado em animais, plantas, fungos e ^2-7. Em alguns animais e plantas, as funções de ARNi sistemicamente, o que significa que o efeito pode espalhar a outras células / tecidos onde ARNcd não é introduzida directamente (revisto em ^8-10). Os cientistas fizeram uso desta resposta RNAi celular endógeno através da concepção de dsRNAs para alveja....