Tillförlitlig identifiering av Living dopaminerga neuroner i mellanhjärnan kulturer Använda RNA sekvensering och TH-promotor-driven EGFP uttryck
Summary
Vid Parkinsons sjukdom (PD), substantia nigra (SNC) dopaminerga neuroner degenererar, vilket leder till motorisk dysfunktion. Här rapporterar vi ett protokoll för odling ventrala mitthjärnan nervceller från en mus som uttrycker EGFP drivs av en tyrosinhydroxylas (TH) promotorsekvens, skörda enskilda fluorescerande nervceller från kulturerna, och mätning av deras transkriptom med hjälp av RNA-punkter.
Abstract
Vid Parkinsons sjukdom (PD) det finns en utbredd neuronal förlust i hela hjärnan med uttalad degeneration av dopaminerga neuroner i SNC, vilket leder till bradykinesi, stelhet och skakningar. Identifieringen av levande dopaminerga neuroner i primära Ventral mesencefala (VM) kulturer med hjälp av en fluorescerande markör ger ett alternativt sätt att studera den selektiva sårbarhet dessa nervceller utan att förlita sig på immunfärgning av fixerade celler. Här, vi isolera, dissociera och kultur mus VM neuroner för 3 veckor. Vi identifierar sedan dopaminerga neuroner i kulturer med hjälp av EGFP fluorescens (drivs av en tyrosinhydroxylas (TH) promotor). Enskilda nervceller skördas i mikrocentrifugrör med hjälp av glasmikropipetter. Nästa, vi lysera de skördade cellerna och utföra cDNA-syntes och transposon-medierad "tagmentation" för att producera enkelcells RNA-Seq bibliotek 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Efter att ha passerat genom kvalitetskontroll check, är biblioteken encelliga sekvenserades och efterföljande analys utförs för att mäta genuttryck. Vi rapporterar transkriptom resultat för enskilda dopaminerga och GABAergic nervceller isolerade från mitthjärnan kulturer. Vi rapporterar att 100% av de levande TH-EGFP celler som skördades och sekvenserades var dopaminerga neuroner. Dessa tekniker kommer att ha omfattande tillämpningar inom neurovetenskap och molekylärbiologi.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD) är en obotlig, åldersrelaterad neurodegenerativ sjukdom. Orsaken till denna relativt vanlig sjukdom fortfarande dåligt förstådd. Det finns en utbredd neuronal förlust i hela hjärnan, med uttalad neuronal degenerering av dopaminerga neuroner i substantia nigra (SNC), vilket leder till diagnostiska kliniska tecken på bradykinesi, stelhet och skakningar.
Primära blandade kulturer innehållande SNC dopaminerga nervceller är särskilt relevanta för Parkinsons sjukdom. Ventrala tegmentområdet (VTA) dopaminerga neuroner har varit inblandade i belöning och missbruk. Ventral mesencefala (VM) primära blandade embryonala kulturer innehåller både SNC och VTA dopaminerga (DA) neuron och GABAergic nervceller. VM primära kulturer kan vara användbara för neuroprotektion analyser och för att belysa den selektiva sårbarhet av dopaminerga neuroner. Det finns ingen tillförlitlig sätt att identifiera dopaminerga celler i odling baserat på morfologi. hanre vi utveckla teknik för att identifiera och skörda enstaka dopaminerga neuroner, och bygga encelliga, högavkastande RNA sekvense bibliotek.
Vi rapporterar representativa RNA transkriptom data för enkel dopaminerga och GABAergic nervceller isolerade från mitthjärnan kulturer. Protokollet kan användas för neuroprotektion, neurodegeneration, och farmakologiska analyser för att studera effekterna av olika behandlingar på DA / GABA transkriptom. Eftersom dopaminerga neuroner utgör en liten minoritet av de nervceller som uttrycks i primär VM kulturer, kommer förmågan att på ett tillförlitligt sätt identifiera dessa nervceller i levande kulturer möjliggöra ett utökat sortiment av single-cellstudier. Dessa nya tekniker kommer att underlätta framsteg inom förstå de mekanismer som äger rum på cellnivå och kan ha applikationer på andra ställen i områdena neurovetenskap och molekylärbiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här isolera vi enskilda celler från en heterogen population med hjälp av en fluorescerande tagg, sedan studera varje cell med encelliga RNA-punkter. Vi rapporterar att 100% av de levande TH-EGFP celler som vi skördade och sekvense var verkligen dopaminerga neuroner, baserat på förekomsten av följande tre DA-relaterade gentranskript, TH, DDC och slc6a3. Alla TH-EGFP positiva celler uttryckte dessa tre gener som bedöms av RNA-Seq. Detta var samstämmiga med elektrofysiologiska studier som visade att varje TH-EGFP …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
Referências
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
