Summary

बहुदबा प्रतिरोधी के लिए रोगाणुरोधी ब्लू लाइट थेरेपी के विवो जांच असिनेतोबक्टेर संक्रमण जला bioluminescence इमेजिंग का उपयोग करना

Published: April 28, 2017
doi:

Summary

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Abstract

जला संक्रमण रुग्णता और मृत्यु दर का एक महत्वपूर्ण कारण बने हुए हैं। बहुऔषध-प्रतिरोधक (एमडीआर) बैक्टीरिया की बढ़ती उद्भव पारंपरिक एंटीबायोटिक उपचार के लगातार विफलता के लिए प्रेरित किया है। वैकल्पिक चिकित्सा विज्ञान तत्काल एमडीआर बैक्टीरिया से निपटने के लिए आवश्यक हैं।

एक अभिनव गैर एंटीबायोटिक दृष्टिकोण, रोगाणुरोधी नीले प्रकाश (ABL), एमडीआर संक्रमण के खिलाफ होनहार प्रभावशीलता दिखाई है। ABL की कार्रवाई के तंत्र अभी तक अच्छी तरह से समझ नहीं है। यह आमतौर पर धारणा है कि स्वाभाविक रूप से बैक्टीरिया में अंतर्जात photosensitizing chromophores होने वाली (जैसे, लोहा मुक्त porphyrins, flavins, आदि) एक प्रकाश रासायनिक प्रक्रिया के माध्यम से ABL, जो बारी में साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन (ROS) से उत्साहित कर रहे हैं।

एक और प्रकाश आधारित रोगाणुरोधी दृष्टिकोण के विपरीत, रोगाणुरोधी प्रकाश गतिक थेरेपी (aPDT), ABL चिकित्सा बहिर्जात photosensitiz की कोई भूमिका नहीं होतीएर। सभी को लागू होने की जरूरत है नीले प्रकाश का विकिरण होता है; इसलिए, यह सरल और सस्ती है। ABL रिसेप्टर्स डीएनए बैक्टीरिया में अंतर्जात सेलुलर photosensitizers के बजाय कर रहे हैं। इस प्रकार, ABL बहुत कम जेनोटोक्सिक से पराबैंगनी-सी (UVC) विकिरण, जो सीधे मेजबान कोशिकाओं में डीएनए की क्षति का कारण बनता है कोशिकाओं की मेजबानी के लिए माना जाता है।

इस पत्र में, हम चोट जला के एक माउस मॉडल में एमडीआर असिनेतोबक्टेर संक्रमण के लिए ABL चिकित्सा की प्रभाविता का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक इंजीनियर-जीव तनाव उपयोग करके, हम noninvasively रहने वाले जानवरों में वास्तविक समय में संक्रमण की हद तक निगरानी करने में सक्षम थे। इस तकनीक को भी पशुओं में संक्रमण के स्थानिक वितरण की निगरानी के लिए एक प्रभावी उपकरण है।

Introduction

जला संक्रमण, जो अक्सर क्योंकि त्वचीय थर्मल चोटों की रिपोर्ट कर रहे हैं, रुग्णता और मृत्यु दर 1 का एक महत्वपूर्ण कारण बने हुए हैं। जला संक्रमण के प्रबंधन आगे एंटीबायोटिक दवाओं के बड़े पैमाने पर उपयोग के कारण बहुऔषध-प्रतिरोधक (एमडीआर) जीवाणु उपभेदों 2 की बढ़ती उद्भव से समझौता किया गया है। एक महत्वपूर्ण एमडीआर ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया असिनेतोबक्टेर है, जो हाल ही में लड़ाई घावों के साथ जुड़े होने के लिए जाना जाता है और लगभग सभी उपलब्ध एंटीबायोटिक दवाओं 3 के लिए प्रतिरोधी है जाता है। घायल फोकी पर biofilms की उपस्थिति 4, 5 की सूचना दी गई है और एंटीबायोटिक दवाओं और मेजबान रक्षा 6, 7 के लिए सहिष्णुता ख़राब माना जाता है, स्थायी संक्रमण के कारण 8, 9। इसलिए, वहाँ एक pressin हैग्राम वैकल्पिक उपचार के विकास के लिए की जरूरत है। मुकाबला एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के लिए हाल ही में घोषणा राष्ट्रीय रणनीति में, एंटीबायोटिक दवाओं के लिए वैकल्पिक चिकित्सा विज्ञान के विकास में संयुक्त राज्य अमेरिका में 10 की सरकार द्वारा एक कार्रवाई के रूप में उल्लेख किया गया है।

प्रकाश आधारित रोगाणुरोधी दृष्टिकोण, जैसा कि नाम से संकेत दिया, के साथ या अन्य एजेंटों के बिना प्रकाश विकिरण की आवश्यकता है। इन तरीकों रोगाणुरोधी प्रकाश गतिक थेरेपी (aPDT), पराबैंगनी-सी (UVC) विकिरण, और रोगाणुरोधी नीले प्रकाश (ABL) शामिल हैं। पिछले अध्ययनों में, वे एमडीआर जीवाणु उपभेदों 11, 12, 13 की हत्या करने में होनहार प्रभावशीलता दिखाई है। तीन प्रकाश-आधारित दृष्टिकोण के अलावा, ABL photosensitizers 14 के उपयोग के बिना उसके अंतर्निहित जीवाणुरोधी गुणों के कारण हाल के वर्षों में ध्यान में वृद्धि को आकर्षित किया है। compar मेंison aPDT को, ABL केवल प्रकाश का उपयोग शामिल है, जबकि aPDT प्रकाश और एक photosensitizer का एक संयोजन की आवश्यकता है। इसलिए, ABL सरल और सस्ती 14 है। UVC की तुलना में, ABL बहुत कम साइटोटोक्सिक और कोशिकाओं 15 की मेजबानी के लिए जेनोटोक्सिक होने का विश्वास है।

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को एक माउस मॉडल में एमडीआर ए असिनोक्टाबक्टोर की वजह से जला संक्रमण के इलाज के लिए ABL की प्रभावशीलता की जांच के लिए है। हम-जीव रोगजनक बैक्टीरिया का उपयोग जला संक्रमण है कि वास्तविक समय में बैक्टीरियल बोझ की गैर इनवेसिव निगरानी की अनुमति देने के नए माउस मॉडल विकसित करने के लिए। शरीर के तरल पदार्थ / ऊतक के नमूने और बाद में चढ़ाना और कॉलोनी की गिनती 16 की पारंपरिक विधि की तुलना में, इस तकनीक सटीक परिणाम प्रदान करता है। ऊतक के नमूने की प्रक्रिया प्रयोगात्मक त्रुटि का एक अन्य स्रोत परिचय सकता है। के बाद से बैक्टीरियल चमक तीव्रता रैखिक संवाददाता के लिए आनुपातिक हैबैक्टीरियल CFU 17 ponding, हम सीधे प्रकाश विकिरण की एक निश्चित खुराक के बाद बैक्टीरिया के अस्तित्व के माप सकते हैं। जानवरों वास्तविक समय में प्रकाश उपचार प्राप्त कर जीने में बैक्टीरियल बोझ की निगरानी करके, बैक्टीरियल हत्या की गतिकी चूहों के एक काफी कम संख्या का उपयोग कर विशेषता जा सकता है।

Protocol

1. बैक्टीरियल संस्कृति की तैयारी ब्रेन हार्ट आसव (भी) एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के माध्यम से 7.5 एमएल जोड़ें। BHI माध्यम में बीज ए असिनोक्टाबक्टोर कोशिकाओं और फिर 18 घंटे के लिए एक कक्षीय इनक्यूबेट…

Representative Results

जैसा कि पहले 12, 17 की सूचना दी ए असिनोक्टाबक्टोर तनाव है कि हम इस्तेमाल किया, एक एमडीआर नैदानिक अलग है। बैक्टीरियल तनाव luxCDABE ओपेरा 11 के अभिकर्मक द्वारा-जी?…

Discussion

ABL संक्रमण के उपचार के लिए एक उपन्यास विधि है। के बाद से कार्रवाई के अपने तंत्र कीमोथेरेपी के कि से पूरी तरह से अलग है, यह एक भौतिक चिकित्सा के अधिक है। एजेंट है कि रोगाणुरोधी प्रभाव मध्यस्थता करता है नील…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.

Materials

IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1X Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery

Referências

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections – a matter of opportunity – monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. . National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria Available from: https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014)
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination?. J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond?. Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).
check_url/pt/54997?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

View Video