Low-Density Primäre Hippocampus Kultur
Summary
Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Kultivierung niedriger Dichte primären hippocampalen Neuronen wachsen auf Glasdeckgläschen über einen einschichtigen glial invertiert. Das Neuron und Glia-Schichten werden durch Paraffinwachsperlen abgetrennt. Die Neuronen durch diese Verfahren gezüchtet sind geeignet für hochauflösende optische Bildgebung und funktionelle Assays.
Abstract
Die Fähigkeit, die Struktur und Physiologie der einzelnen Nervenzellen in Kultur zu untersuchen ist entscheidend für das Studium der Neurobiologie und ermöglicht Flexibilität bei der genetischen und chemischen Manipulation einzelner Zellen oder Netzwerk definiert. Eine solche einfache Manipulation in der reduzierten Kultursystem einfacher, wenn auf den intakten Hirngewebe verglichen. Während viele Verfahren zur Isolierung und Wachstum dieser primären Neuronen vorhanden sind, jeder hat seine eigenen Beschränkungen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Kultivierung von niedriger Dichte und hohe Reinheit rodent embryonale Hippocampusneuronen auf Glasdeckgläschen, die dann über eine Monoschicht von Gliazellen suspendiert. Diese ‚Sandwich-Kultur‘ ermöglicht exklusives langfristiges Wachstum einer Population von Neuronen während von der darunterliegenden Glia einschichtigen für trophische Unterstützung ermöglicht. Wenn Neuronen ausreichenden Alters oder Reifegrad sind, können die Deckgläser werden in Neuronen Bildgebung oder funktionelle Assays klappt den glial dish und verwendet wird. Neurone grown durch dieses Verfahren typischerweise mehrere Wochen überleben und umfangreiche Dorne, synaptische Verbindungen entwickeln und Netzwerkeigenschaften.
Introduction
Das Gehirn ist in komplizierte Netzwerke von Neuronen organisiert. Der Beitrag der einzelnen Neuronen zu Netzwerk-Aktivität und Funktion des Gehirns kann durch selektive Veränderung ihrer molekularen Zusammensetzung und perturbance ihrer physiologischen Eigenschaften untersucht werden. Genetische und chemische Manipulation einzelner Neuronen ist wohl einfacher in kultivierten Neuronen als in intakten Hirngeweben, unbelastet von dem zellulären Heterogenität und Komplexität des letzteren. Neurone in Kultur entwickelt wohldefinierte axonalen und dendritischen Dorne und miteinander umfangreiche synaptischen Verbindungen bilden.
Während Neuron Kultur von erwachsenen Tieren oder aus anderen Regionen des Nervensystems möglich ist, werden embryonale Hippocampus – Kulturen aufgrund ihrer definierten Pyramidenzellpopulation häufig bevorzugt und eine relativ geringe Dichte Glia 1, 2. Hippocampus-Neuronen bei niedriger Dichte in Kultur gezüchtet sind besonders ameNable auf die Untersuchung von subzellulärer Lokalisierung, Protein Handel, Entwicklung neuronaler Polarität und Synapse. Neuronen in Kultur wird auch bei der Untersuchung molekulare Prozesse in der synaptischen Plastizität 3, 4, 5, 6 extensiv verwendet worden. Neuron Kultur Präparate von Mäusen , die mit globalen genetischen Deletionen , die postnatal nicht überleben haben sich als besonders nützlich erwiesen in 7 zellulären und synaptischen Rollen bestimmter Gene zu studieren.
Wie im Gehirn, kultiviert Hippocampus-Neuronen abhängig von trophischen Unterstützung von Gliazellen. Dies erschwert ihre Kultur, und hat zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt, durch die diese Unterstützung geliefert wird. Ein allgemein verwendetes Verfahren beinhaltet Neuronen direkt auf eine Monoschicht von Gliazellen Plattierung 8 oder Verunreinigung ermöglichen Gliazellen aus dem erfassten Hippocampal Gewebe proliferieren und eine Monoschicht unter den Neuronen 9 zu bilden. Während dieses Verfahren einen gewissen Erfolg gefunden hat, ist die Verunreinigung der resultierenden neuronalen Kultur für die Bildgebung Experimente unvorteilhaft. Eine weitere , häufig verwendete Methode der Neuronenkultur verlassen den glial-out feeder insgesamt Schicht und stattdessen trophische Unterstützung in der Form eines definierten Wachstumsmediums 10 bereitzustellen.
Hier beschreiben wir das „Sandwich“ oder „Banker“ Methode der Neuron Kultur 2, 11. Dieses Verfahren beinhaltet die Hippokampus-Neuronen auf Glasdeckgläschen Plattierung, die dann über eine Monoschicht von Gliazellen durch Paraffinwachsperlen abgetrennt suspendiert. Dies erleichtert die langfristige Kultur einer homogenen Population von Neuronen ohne Glia kontaminiert, während für trophische Unterstützung von dem darunterliegenden Glia einschichtigen ermöglicht. Wenn Neuronen sind von ausreichendem Alter oder Reifegrad,die Neuronendeckgläser kann der glial Schale und verwendet in Bildgebung oder funktionelle Assays klappten werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während das „Sandwich“ Verfahren zur Kultivierung Neuronen gut beschrieben worden ist , an anderer Stelle 2, 11, gibt es mehrere Schritte im gesamten Protokoll , das ziemlich schwer allein zu beschreiben , in Text, der für die Ermittler zu Frustration führen kann , die es annehmen wollen.
Glia-Kultur, Deck Vorbereitung und Neuron Kultur und Unterhaltung: Das Verfahren kann in drei großen Workflows unterteilt werden. Jede der …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von CIHR MOP-142209 auf TJS unterstützt.
Materials
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
Referências
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- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons–views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
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- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
