JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

Küçük hayvanlarda kalp uzunlamasına bir çalışma gibi gen ile ilgili konjenital kalp defektleri 1,2 gibi insan ilgili kardiyovasküler hastalıklar, çeşitli anlamak için katkıda bulunur. Geçmiş yıllarda, fare, 3,4, Xenopus 5,6 zebra balığı 7,8, kuş 9 ve Drosophila 10-16 gibi çeşitli hayvan modellerinde,, araştırma ile ilgili, insan kalp geliştirme çalışmaları için kullanılmıştır. Fare modeli yaygın normal ve anormal kalp gelişimi ve insan kalbi 3,4 ile benzerlikler nedeniyle kalp kusur fenotipleri incelemek için kullanılır olmuştur. Xenopus embriyo nedeniyle kolay kullanım ve kısmi şeffaflık 5,6 kalp gelişimi çalışmada özellikle yararlıdır. Embriyo ve zebra balığı model erken larva şeffaflık kalp gelişimi 7,8 kolay optik gözlem için izin verir. kuş modeli gelişimsel kalp çalışmalarının ortak bir konudur because Kalp kolayca yumurta kabuklarını ve insanlarda 9 kuş kalplerin morfolojik benzerliği çıkardıktan sonra ulaşılabilir. Drosophila modeli kalbin uzunlamasına çalışmalar yapmak için ideal hale bazı benzersiz özelliklere sahiptir. İlk olarak, Drosophila kalp tüpü kalbin optik erişim ve gözlem için kolaylık sağlar dorsal yüzeyinin altında ~ 200 mikron vardır. Ayrıca, birçok moleküler mekanizmaları ve genetik yollar Drosophila ve omurgalılar arasında muhafaza edilir. İnsan hastalık genlerinin 75 üzerinde% ortologlar yaygın transgenik çalışmalarda 11,13 kullanılan yapmış Drosophila, bulundu. Ayrıca, kısa bir ömrü ve düşük bakım maliyetleri vardır ve yaygın gelişimsel biyoloji araştırma 14-16 bir örnek model olarak kullanılmıştır.

Önceki raporlar o gibi Drosophila kalp fonksiyonlarını izlenmesi için protokol tarifArtbeat. Bununla birlikte, diseksiyon işlemleri 17,18 gerekmiştir. Optik görüntü nedeniyle non-invaziv doğası hayvanlarda kalp gelişimini görselleştirmek için etkili bir yol sağlar. Farklı optik görüntüleme yöntemleri gibi iki foton mikroskopi 19, konfokal mikroskopi 20,21, hafif levha mikroskobu 22, ve optik koherens tomografi (OCT) 16,23-26 olarak, performans hayvan kalp çalışmada uygulanmıştır. Nispeten, Ekim görüntüleme canlı hayvanlar için önemli olan yüksek çözünürlük ve Ultrahigh görüntüleme hızı, tutarken, kontrast maddeleri kullanmadan küçük hayvan kalplerinde büyük bir görüntüleme derinliğini sağlama yeteneğine sahiptir. Ayrıca, bir Ekim sistemini geliştirme düşük maliyetli örneklerinin optik görüntüleme için bu tekniği yaygınlaştırmıştır. Ekim başarıyla Drosophila boyuna çalışma için kullanılır olmuştur. Ekim, kalp morfolojik ve fonksiyonel görüntüleme kalp yapıları incelemek için yapılmıştır kullanma, işlevtional genlerin rolleri ve kalp gelişimi sırasında mutant modellerde kardiyovasküler kusurların mekanizmaları. Örneğin, yaşa bağlı kardiyak fonksiyon düşüş OCT 27 Drosophila aşağı-regüle anjiotensin dönüştürücü enzim ilgili (ACER) geni ile teyit edilmiştir. Gen ile ilgili kardiyomiyopati fenotiplendirme OCT 28-33 kullanılarak Drosophila gösterilmiştir. Araştırma kullanarak Ekim de Drosophila 34 kalbinde insan SOX5 geninin fonksiyonel rolünü ortaya koymuştur. OCT ile karşılaştırıldığında, OCM daha enine çözünürlük sağlamak için daha yüksek bir sayısal diyafram ile objektif kullanır. Geçmişte, bir ortologu insan sirkadiyen geni dCry / dClock susturma kaynaklanan kalp fonksiyon bozukluğu, obezite kaynaklı insan anlamak için özel bir OCM sistemi 15,16 yanı sıra Drosophila kardiyomiyopatilerde yüksek yağlı-diyetin etkisini kullanarak çalışılmıştır kalp hastalıkları. 15

Burada, inciE deneysel protokol ikinci dönem (L2), üçüncü instar (L3), pupa gün 1 (PD1), pupa günde 2 (PD2), pupa gün 3 de Drosophila kalp morfolojik ve fonksiyonel değişikliklere boyuna çalışma için (PD3) özetlenmiştir , pupa gün 4 insan kaynaklı doğumsal kalp hastalıklarının çalışma kolaylaştırmak için OCM kullanarak (PD4), pupa gün 5 (PD5) ve yetişkin (Şekil 1). İK ve CAP olarak kardiyak fonksiyonel parametreler, kantitatif kalp gelişim özellikleri ortaya çıkarmak için farklı gelişim aşamalarında analiz edildi.

Protocol

Drosophila 16 optik görüntüleme OCM Sistemi 1. Hazırlık Bir spektrometre ve OCM sistemi Drosophila kalp atışı çözmek mümkün olacak, böylece en az 80 kare / sn kare hızı sağlayan yüksek hızlı hat tarama kamerayı seçin. Drosophila kalp yapısını belirlemek için 2 um eksenel çözünürlük sağlamak için geniş bant ışık kaynağı kullanın. Bir yüksek enine çözünürlük elde etmek için bir 10X objektif kullanarak. <…

Representative Results

uzunlamasına kardiyak görüntüleme OCM ile oda sıcaklığında 24B-GAL4 / + suşu ile meyve sinekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ölçümler L2, L3 gerçekleştirilen ve PD4 PD1 8 saat aralıklarla ve yetişkin günlük 1 (AD1) başkalaşım süreci (Tablo 1) izlemek için bulundu. Larva erken Pupa geç pupa ve yetişkin sinek Şekil 1A görüldüğü gibi, cam lam üzerine yerleştirilmiştir. Larva ve ergin sinekler için kalbin segmenti özellikleri Şekil 1B<…

Discussion

Larva ve ergin dönemlerinde 400 bpm civarında maksimum HR Drosophila hızlı kalp atışı, kalp diastoles ve systoles (tecrübelerine dayanarak en az 80 kare / sn) gidermek için yüksek görüntüleme hızı gerektirir. Nedeniyle küçük kalp odası büyüklüğü ve mikron ölçekli kalp duvar kalınlığına (5-10 um), yüksek uzamsal çözünürlük (2 um daha iyi) kalp tüpü yapılarının çözülmesi için gereklidir. Bu çalışmada, yüksek çözünürlüklü ve ultra hızlı OCM sistemi ızgara 6…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -. T., Chang, C. -. Y., Su, M. -. T., Kuo, W. -. C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer’s disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. . Laboratory culture of Drosophila. 2a, 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. . Drosophila: a laboratory handbook. , (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Tags

DrosophilaHeart FunctionOptical Coherence Microscopy (OCM)Cardiac DevelopmentLongitudinal ImagingIn VivoMetamorphosisGenetic SimilaritiesVertebratesOptogenetic PacingPacemaker FunctionLarva MountingDevelopmental StageHeart TubeA-scansB-scansScanner VoltageTransverse Direction
check_url/pt/55002?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image