Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.
Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.
Estudo longitudinal do coração em animais pequenos contribui para a compreensão de uma variedade de doenças cardiovasculares relacionados humanos, tais como relacionado com o gene defeitos cardíacos congénita 1,2. Nas últimas décadas, vários modelos animais, tais como 3,4 rato, Xenopus 5,6, peixe-zebra 7,8, aviária 9 e Drosophila 10-16, têm sido usados para conduzir o coração desenvolvimento humano relacionados com a investigação. O modelo do rato tem sido amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento cardíaco normal e anormal e fenótipos defeito cardíaco devido às suas semelhanças com o 3,4 coração humano. O embrião Xenopus é especialmente útil no estudo do desenvolvimento do coração devido ao seu fácil manuseio e 5,6 transparência parcial. A transparência do embrião e larva início do modelo peixe-zebra permite a observação óptica fácil de 7,8 desenvolvimento cardíaco. O modelo aviária é um assunto comum de estudos cardíacos desenvolvimento because o coração pode ser facilmente acessado após a remoção das cascas de ovo e a semelhança morfológica dos corações de aves para os seres humanos 9. O modelo de Drosophila tem algumas características únicas que a tornam ideal para a realização de estudos longitudinais do coração. Em primeiro lugar, o tubo de coração de Drosophila é de ~ 200 um abaixo da superfície dorsal, que fornece a conveniência para o acesso óptico e observação do coração. Além disso, muitos mecanismos moleculares e vias genéticas são conservadas entre Drosophila e vertebrados. Os ortólogos de mais de 75% dos genes humanos da doença foram encontrados em Drosophila, que tornaram amplamente utilizado em estudos transgénicos 11,13. Além disso, ele tem um ciclo de vida curto e baixos custos de manutenção, e tem sido utilizada como um modelo de amostra para investigação em biologia de desenvolvimento 14-16.
Relatórios anteriores descritos os protocolos para monitorar funções cardíacas Drosophila como o que eleArtbeat. No entanto, os procedimentos de dissecação foram necessários 17,18. imageamento óptico oferece uma maneira eficaz de visualizar desenvolvimento cardíaco em animais devido à sua natureza não-invasiva. Diferentes modalidades de imagens ópticas têm sido aplicados na realização de estudo cardíaca animal, tais como a microscopia de dois fótons 19, microscopia confocal 20,21, microscopia folha de luz 22 e tomografia de coerência óptica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, outubro é capaz de fornecer grande profundidade de imagem nos corações de pequenos animais sem o uso de agentes de contraste, mantendo uma alta resolução e uma velocidade de imagem ultra, que são importantes para os animais vivos de imagem. Além disso, o baixo custo de desenvolvimento de um sistema outubro popularizou esta técnica de imageamento óptico de espécimes. Outubro foi utilizado com sucesso para o estudo longitudinal de Drosophila. Usando OCT, imagiologia morfológica e funcional cardíaca foi realizada para estudar as estruturas do coração, o funcpapéis adicionais de genes e os mecanismos de defeitos cardiovasculares presentes em modelos mutantes durante o desenvolvimento cardíaco. Por exemplo, o declínio da função cardíaca dependente da idade foi confirmada com gene regulado por baixo de conversão da angiotensina relacionadas com a enzima (ACER) em Drosophila com 27 de outubro. Fenotipagem de cardiomiopatia relacionada gene foi demonstrada em Drosophila usando outubro 28-33. A pesquisa usando outubro também revelou o papel funcional do gene humano SOX5 no coração de Drosophila 34. Em comparação com outubro, a CCE utiliza uma objetiva com uma abertura numérica maior para proporcionar uma melhor transversal resolução. No passado, a disfunção cardíaca causada por silenciar um gene circadiano humano ortólogo dCry / dCLOCK foi estudado utilizando um sistema personalizado 15,16 OCM, bem como o efeito de elevado teor de gordura por dieta em cardiomiopatias em Drosophila compreender obesidade induzida humana doenças cardíacas. 15
Aqui, the protocolo experimental é resumido para o estudo longitudinal das alterações morfológicas e funcionais cardíacas em Drosophila no segundo instar (L2), terceiro estádio (L3), dia pupa 1 (PD1), dia pupa 2 (PD2), pupa dia 3 (PD3) , pupa dia 4 (PD4), pupa dia 5 (PD5), e adulto (Figura 1) através da CCE para facilitar o estudo de doenças cardíacas congénitas humanos relacionados com. Cardíacas parâmetros funcionais, tais como RH e CAP foram analisados quantitativamente em diferentes estágios de desenvolvimento para revelar as características de desenvolvimento cardíacos.
A rápida pulsação de Drosophila, com um FC máxima em torno de 400 bpm em estágios larvais e adultas, requer alta velocidade de imagem para resolver os diástoles cardíacos e sístoles (não inferior a 80 frames / seg com base em experiências). Devido à dimensão da espessura de tamanho pequeno da câmara do coração e da parede do coração mícron (5 – 10 um), uma resolução espacial elevada (superior a 2 mm) é necessária para a resolução de estruturas de tubo coração. Neste estudo, um sistema …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.
Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
Cover glass | AmScope | 200PCS | |
Cotton Ball | RITE AID | ||
Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
Yeast | ActiveDry | ||
Microscope | SONY | WILD M420 | |
Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
Labview software | National Instruments | ||
Image J | National Institutes of Health | ||
Matlab | Mathworks | ||
Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M | Scotch | ||
Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |