Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트<em> 다니오 레 리오</em>)
Summary
이 방법은 효율적으로 암세포의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 제브라 피쉬 배아를 이용한다. 형광 암세포 개발 배아 precardiac 부비동 또는 난황 낭에 주입된다. 암 세포 혈관 침윤 및 혈관 외 유출은 24-96 시간 후 꼬리 영역의 형광 현미경을 통해 평가된다.
Abstract
Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.
Introduction
전이성 암 사망률과 암세포의 확산을 가능하게 한 것을 발견 할 많은 유지기구의 주요 원인이다. 성공적으로 전이하는 암 세포에 대한 위해서는, 먼저 순환 시스템으로 (intravasate)를 입력, 기본 종양 주위의 기질을 통해 침입한다, 순환에서 통과, 출구 (extravasate)에서 살아 남기, 그리고 마지막으로 가능한 식민지를 구축 먼 장기 사이트 2에서. Intravasation 및 혈관 외 유출 따라서 전이성 폭포에서 중요한 단계이며, 아직 모든 암 세포는 파괴와 내피 접합 (3)를 통해 마이그레이션에 본질적으로 숙달되지 않습니다. 사실, 암세포의 혈관 침입을 둘러싸고 처리가 상기 내인성 및 외인성 인자 4 다양한 영향을받을 수있는 유일한 선택 압력의 시리즈가있다. 이러한 이유로, 고급 단계 암의 공격적인 행동을 조사 기법은 종종 V에 초점전이성 확산을 예측하는 수단으로서 기능 침습 ascular.
다양한 모델 시스템은 시험 관내에서 암세포의 침윤, 혈관의 조사를 용이하게하기 위해 존재한다. 대부분의 시험 관내 분석에서 사용하는 암 세포 (6)에 의한 손상 내피 단층 실시간 중단을 모니터링하는 내피 장벽 5 또는 전지 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS) 기술을 통해 암 세포의 이동을 평가하기 위해 하나 트랜스 웰 시스템을 포함한다. 이러한 분석은 일반적으로 그렇지 내피 벽 암세포 부착에 영향을 줄 것 인 유체 역학 및 간질 인자 부족하다. 이 문제는 다소 기질 세포를 지원하여 내피 세포의 3 차원 배양에서 발생 관류 혈관 네트워크가 회피되고, 이러한 3D 미세 유체 시스템은 지금 체외에서 현재 옵션 7,8의 선두를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 기능성 순환계의 견고한 미세 생략따라서 단지 생체 내 모델에 대한 부분을 대신한다.
가장 널리 혈관 침범 생체 내 모델에서 사용은 상대적으로 짧은 시간 척도 발생 및 전이 능력 9 일반적 나타내는 때문에 실험 전이 분석은 일반적으로 수행되는 마우스이다. 이러한 분석은 순환에 암 세포를 직접 주입을 수반하기 때문에 전이 기관, 즉 혈관 외 유출 및 암 세포 집락의 말기 모델. 실험 전이 분석은 암세포 주사 부위에 따라 다를 상기 기관은 궁극적으로 분석 하였다. 제 분석 유형에있어서, 암세포가 폐에 마우스와 암세포 시드의 꼬리 정맥에 주입은 10, 11을 모니터링한다. 두 번째 분석은 뼈쪽으로 미세 12-14 전이성 시드를 직접 심장 내 주사를 수행 할뿐만 아니라 뇌 (15) 포함한다. 제 분석에서, 암 C학습 학생은 경동맥 내로 넷째 전달 경로 (17, 18)은 뇌에 암 세포를 전달하는 반면, 간 (16)의 정착을 허용하기 위해 비장에 주입된다. 관계없이 암 세포 전달 방법의 장기 집락은 허용 실험적 포인트이며, 일반적으로, 발광, 조직학, 또는 PCR 계 기술을 통해 결정된다. 쥐 호스트 내에서 실험 전이 분석을 수행의 생리적 인 장점에도 불구하고,이 실험은 아직 완료하고 분석 개월 주를 필요로한다.
제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 모델은 최근 암의 진행 (19, 20)을 연구하는 새로운 시스템으로 부상하고 마우스 21-24에 비해 훨씬 짧은 시간 척도를 통해 기능 순환 시스템 내에서 암세포 혈관 침윤의 평가를 할 수있다. 이 방법은 내피 세포가 녹색 암초 산호 FLUO 태그 한 투명 제브라 피쉬의 변형을 이용하여kdrl 촉진제, 혈관 내피 성장 인자 (25)에 대한 수용체 제브라 구동 rescent 단백질 리포터. 상기 분석에서, 암 세포는 적색 형광 마커로 표지되며,이 일된 태아의 precardiac 부비동 주입. 외부에서 48 시간 내지 96 사이에 주입 한 후, 혈관에서 배아의 꼬리 영역으로 침범 암 세포는 형광 현미경을 효율적으로 획득 할 수있다. 여기서 우리는 혈관 침입 능력 뚜렷한 차이를 보여주기 위해 일반적으로 사용되는 인간 유방암 세포주의 패널 기술을 적용한다. 더욱이, 우리는 암세포 집단이 차분 형광 염료로 표지 된 형광 혈관 부족 제브라 피쉬 배아 내로 주입 될 수있는 배아 난황낭로 주사 부위를 변경하는 이종 세포 상호 작용의 연구를 허용 함을 입증. 이 후자의 분석에서, 노른자를 침공 한 암 세포는 vasculatur에 intravasated전자는 주사 후 48 시간에 꼬리 영역 (24)에 득점있다. 이에 모델의 효율성 및 편의에 제브라 점점 빠르게 생리 학적 환경 하에서 암세포의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 사용된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기술은 효과적으로 암세포 (도 1 참조)의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 제브라 모델을 이용한다. (- 3,도 2, 표 1 참조) 여기에서는, 다른 연구자들은 다음 자신의 연구를 구축 할 수가있는 기준을 제공하기 위해 유방암 세포주의 패널 기술을 적용 하였다. MDA-MB-231 세포가 쉽게 제브라 피쉬 배아의 꼬리 영역에 침입 관찰은 혈관 침윤을 억제 할…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0MM | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100mm x 15mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
Referências
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