安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
高等生物は、より複雑な機能をもたらすために協力異なる細胞型の複雑なコミュニティを含みます。例えば、腫瘍は、癌細胞だけでなく、線維芽細胞、血管を構成する細胞だけでなく、を含み、多くの場合、免疫細胞は、1浸潤します;血液は、免疫細胞サブタイプ2の数十の複雑な混合物が含まれています。さらには培養細胞株は、乳癌細胞3の管腔および基底サブタイプなどの複数の亜集団、から構成されてもよいです。また、共存する異なる細胞型は、代謝、「コラボレーション」を示すことができます。例えば、脳内で、アストロサイトは、この基板4を酸化ニューロンへのその後「摂食」である乳酸にグルコースを変換するために考えられています。 Tリンパ球は、システイン5の供給源として、隣接する樹状細胞に依存して、いくつかの状況です。そして癌細胞はASSOと協力することができます腫瘍6でciated線維芽細胞。このようなシステムの代謝挙動を理解するために、存在する種々の細胞型の代謝活動を分離して測定することが不可欠です。
はるか細胞型を分離するために最も広く使用される方法は、蛍光活性化細胞選別です。この方法は広く適用可能であり、目的の細胞型または状態は、蛍光抗体、操作された蛍光タンパク質の発現、又は他の染料を使用して、「標識された」ことができることを条件とします。 1つのオプションは、次にセルソーター、得られた再培養個々の細胞型、及び貫通最初は別個の細胞タイプは、これらの培養物7の代謝試験を行うことです。細胞型または表現型は、培養条件で安定であり、そのような細胞周期状態を、また、共培養における代謝協力として過渡的な挙動を捕捉することができない場合は、これは実現可能です。このような場合のために、代謝がそうで直接測定されなければなりませんRTED細胞。セルは手順をソートするので、これは困難である彼らの新陳代謝8を歪めることがストレスに細胞を施し、そして我々はこのアプローチ9、10を取るだけ少数の研究を認識しています。特に、我々は絶対的な代謝産物の存在量の測定は、もはや信頼性があるように、アミノ酸等の主要な代謝産物は、細胞ソーティングバッファに保持した細胞から漏れないことを見出した11（ソートされた画分の間の相対的な比較は依然として価値があるかもしれません）。
これらの問題を回避するために、我々は、ソートする前に、安定同位体で細胞を標識し、細胞代謝産物ではなく、代謝物の存在量でのMIDに焦点を当てます。 MIDは長い時間スケール上に形成されているので、それらは以下のソート条件に短期暴露の影響を受けなければなりません。我々は、DAを提供するのに十分な感度でフルスキャンの高分解能質量分析を使用してのMIDを定量化セルソーティング時間の約30〜60分を必要とする50万選別した細胞から始まる代謝物の何百も、上のta。培養皿から直接制御（細胞は、任意の特定の集団をゲーティングすることなく、セルソーター器を通過した）および代謝物の抽出を「モックがソート」との比較は観察のMIDは、元の培養中のものの代表であることを保証するために行われます。安定同位体トレーサーの選択に応じて、様々な代謝経路は、この方法で研究することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々の方法は、細胞代謝産物中のMIDは、細胞の代謝活性の「歴史」を反映している原理に基づいています。これは、細胞の複雑なコミュニティで生じたような従来の細胞選別手順と、細胞の亜集団における代謝活性を調査することができます。これとは対照的に、代謝物のピーク面積は、ソートされた細胞と培養皿11から直接抽出の抽出物との間で著しく異なります。部分?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
Referências
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