Une méthode pour mesurer le métabolisme dans des communautés triées sous-populations cellulaires complexes Utilisation Stable Isotope Tracing
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
les organismes supérieurs contiennent des communautés complexes de types cellulaires distincts qui collaborent pour réaliser des fonctions plus complexes. Par exemple, les tumeurs contiennent non seulement les cellules cancéreuses, mais aussi des fibroblastes, des cellules qui constituent les vaisseaux sanguins et de cellules immunitaires souvent infiltrats 1; sang contient un mélange complexe de plusieurs dizaines de sous – types de cellules immunitaires 2; et même des lignées cellulaires cultivées peuvent être constituées de plusieurs sous – populations, comme l'luminale et les sous – types de base de cellules de cancer du sein 3. De plus, les types de cellules distinctes qui coexistent peut présenter métabolique "collaboration". Par exemple, dans le cerveau, les astrocytes sont pensés pour convertir le glucose en lactate qui est ensuite «alimenté» pour les neurones qui oxydent ce substrat 4; Les lymphocytes T sont dans certains contextes , qui dépendent des cellules dendritiques adjacentes en tant que source de cystéine 5; et les cellules cancéreuses peuvent collaborer avec des assofibroblastes ciés dans les tumeurs 6. Pour comprendre le comportement métabolique de tels systèmes, il est nécessaire de séparer et de mesurer les activités métaboliques des différents types présents de cellules.
De loin, la méthode la plus largement utilisée pour séparer les types de cellules est le tri cellulaire activé par fluorescence. Ce procédé est largement applicable, à condition que le type de cellule ou d'un état d'intérêt peuvent être "marqués" en utilisant des anticorps fluorescents, l'expression de protéines fluorescentes modifiées, ou d'autres colorants. Une option est de types de cellules initialement séparées par un trieur de cellules, re-culture les types cellulaires individuels obtenus, puis effectuer des études sur le métabolisme de ces cultures 7. Toutefois, cela est seulement possible si le type de cellule ou d'un phénotype est stable dans des conditions de culture, et ne peuvent pas capturer le comportement transitoire tels que les états du cycle cellulaire, ni la coopération métabolique dans les co-cultures. Pour de tels cas, le métabolisme doit être mesurée directement sur tantcellules rted. Cela est difficile car la cellule procédure de tri soumet les cellules à des contraintes qui peuvent fausser leur métabolisme 8, et nous sommes conscients de seulement quelques études qui suivent cette approche 9, 10. En particulier, nous avons constaté que les principaux métabolites tels que les acides aminés peuvent fuir à partir de cellules conservées dans un tampon de tri cellulaire, de sorte que les mesures de l' abondance absolue des métabolites ne sont plus fiables 11 (bien que la comparaison relative entre fractions triées peut encore être utile).
Pour contourner ces problèmes, nous appelons les cellules avec des isotopes stables avant le tri, et de se concentrer sur les MIDs en métabolites cellulaires, plutôt que les abondances métabolites. Depuis MIDs sont formés sur des échelles de temps plus longues, ils devraient être moins affectés par l'exposition à court terme à des conditions de tri. Nous quantifions MIDs utilisant-balayage complet à haute résolution spectrométrie de masse, ce qui est assez sensible pour fournir data sur des centaines de métabolites à partir de environ 500.000 cellules triées, nécessitant environ 30-60 min de la cellule de temps à trier. Une comparaison entre un "mock triée" contrôle (cellules transmises à travers l'instrument de trieur de cellules sans gating une population spécifique) et l'extraction des métabolites directement à partir de la boîte de culture est faite pour veiller à ce que les MIDs observés sont représentatifs de ceux de la culture d'origine. En fonction du choix des traceurs isotopiques stables, diverses voies métaboliques peuvent être étudiés par cette méthode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre méthode est basée sur le principe que MIDs dans les métabolites cellulaires reflètent l ' «histoire» des activités métaboliques d'une cellule. Ceci permet d'étudier les activités métaboliques dans les sous- population de cellules, car ils se sont produits dans le milieu complexe de cellules, préalablement à la procédure de tri cellulaire. En revanche, les zones de pointe de métabolites diffèrent sensiblement entre les extraits de cellules triées et extraction directe à partir de la bo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
Referências
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. . Practical flow cytometry. , (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
