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Imunologia e Infecção

inoculando<em> Anopheles gambiae</em> Os mosquitos com grânulos para induzir e medir a melanizacao Resposta Imunológica

Published: January 12, 2017
doi:
10.3791/55013
, , ,
1Laboratoire d’écologie et d’épidémioloigie parasitaire, Institut de biologie,Université de Neuchâtel, 2Merkle Lab, Department of Entomology,Pennsylvania State University

Summary

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Abstract

A estimulação de respostas imunes é uma ferramenta comum em estudos de invertebrados para examinar a eficácia e os mecanismos de imunidade. Esta estimulação é baseado em a injecção de partículas não patogénicas em insectos, como as partículas vão ser detectado pelo sistema imunológico e induzem a produção de efectores imunitários. Nós nos concentramos aqui na estimulação da resposta melanizacao no mosquito Anopheles gambiae. Os resultados de resposta melanizacao no encapsulamento de partículas estranhas e parasitas com uma camada escura de melanina. Para estimular essa resposta, os mosquitos são inoculados com contas na cavidade torácica, utilizando tubos microcapilar de vidro. Então, depois de 24 horas, os mosquitos são dissecados para recuperar as contas. O grau de melanização do grânulo é medida utilizando software de análise de imagem. Grânulos não têm os efeitos patogénicos de parasitas, ou a sua capacidade de evitar ou suprimir a resposta imunitária. Estas injecções são uma forma de measure eficácia imunológico e o impacto da estimulação do sistema imunológico em outros traços da história de vida, tais como fecundidade e longevidade. Ele não é exactamente o mesmo que estudando directamente interacções hospedeiro-parasita, mas é uma ferramenta interessante para o estudo da imunidade e da sua ecologia evolutiva.

Introduction

Insetos dependem de respostas imunes para se proteger contra parasitas e patógenos 1 – 3 que violam através da sua cutícula ou a sua epitélio do intestino médio 4. Em mosquitos, estas respostas são eficientes contra bactérias, vírus 5 6, nematóides filarial 7 e parasitas da malária 1,8,9. Em mosquitos, uma resposta imune chave é a encapsulação de partículas estranhas com melanina 10-12. Este encapsulamento pode ocorrer no intestino ou na hemolinfa sistema de circulação 10 – 12. Esta resposta melanização é o resultado de o pró-fenoloxidase cascata 10 – 12, e que pode conduzir à morte dos parasitas ou a sua fagocitose. Em mosquitos adultos, onde o número de células hemócitos é limitado, melanização é uma resposta humoral, como contra parasitas de Plasmodium ou nemátodos filariais 7.Em alguns outros insetos, é diretamente as células hemócitos que se reúnem em torno do parasita para melanize-los 7. Além disso, a melanina também é essencial para vários outros processos fisiológicos como a produção de ovos e feridas cutícula cura 7.

A estimulação de respostas imunes é usado como uma ferramenta para o estudo da imunidade de insectos em vários sistemas de modelo de saúde pública agrícola e 13 – 18. É utilizado em Anopheles gambiae os mosquitos, o principal vetor de malária na África, para estudar as interações parasita-hospedeiro 14 – 16,19. Estas técnicas baseiam-se na capacidade de insectos para detectar parasitas com os seus receptores de reconhecimento de padrões (PRR) 2. Os mosquitos também pode detectar outras moléculas que interferem com a sua biologia, como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), ou detectar suas próprias células danificadas devido à liberação de colágeno e ácidos nucleicos. A célula imune mosquitos tais como os hemócitos são utilizados para a detecção de 20-23. As principais vias de sinalização imunes são IMD, Toll, JAK / STAT 24, e interferência do ácido ribonucleico (RNAi) 25,26. Ambos Toll e vias IMD influenciar a resposta melanizacao e interagir com o pró-fenoloxidase cascata 10-12.

A ferramenta de padrão usado para estimular a resposta melanização é a inoculação de um mosquito com um pequeno rebordo na hemolinfa da cavidade torácica. O grau de encapsulamento melanina pode então ser medida 19 depois de recuperar o cordão através da dissecação do mosquito. Na maioria dos estudos, apenas uma esfera foi injectada por mosquito 15,16,27, mas injectando mais grânulos é possível, a fim de estudar os limites da resposta melanização 19. Estes grânulos são injectados utilizando uma solução para injecção (soro fisiológico), para limitar a perturbação do mosquito e fisiologiaa dessecação do mosquito 15,16,27. Um corante é adicionado a esta solução para facilitar a selecção de grânulo. É o mesmo para a solução de dissecção usado para recuperar o grânulo 15,16,27.

A vantagem de inoculação de insectos com estímulos não patogénico é a capacidade de focar sobre o efeito directo sobre a resposta imune. Não há efeitos que complicam devido ao parasita patogenicidade 28, imunossupressão 29-31, ou a evasão imune 31-34. Além disso, as consequências das estimulações de outras características da história de vida, tais como a longevidade ou fecundidade, pode também ser estudado. Assim, os pesquisadores que estudam ecologia evolutiva pode exigir tais ferramentas 2,35,36. Por exemplo, zangões desafiou-imuno têm uma vida útil encurtada sob fome. efeitos negativos semelhantes de estímulos imunitários e implantações foram observadas em diferentes modelos de invertebrados, resultando muitas vezes num curtoer a vida útil ou o sucesso reprodutivo menos 13,27,37. Tais estudos podem ser realizados em ambientes variados 2,4,38. Estimular a imunidade também é de interesse para aqueles focando diretamente imunopatologia 39,40.

Este protocolo baseia-se na inoculação de grânulos com mosquitos para estimular a resposta melanização e directamente medem a quantidade de melanina. Isso permite estudo quantitativo e qualitativo da resposta melanizacao em diferentes configurações experimentais. Uma tal ferramenta pode ser estendido para a estimulação de outras respostas imunes, tais como a resposta antibacteriana a bactérias 41 aquecer-morto. Ele também pode ser realizado em muitos contextos ecológicos.

Protocol

1. solução salina por injeção e Dissection Preparar a solução salina através da adição de NaCl, KCl, e CaCl 2 de água destilada para obter NaCl 1,3 mM, KCl 0,5 mM, e CaCl 2 0,2 mM, a pH = 6,8. Adicionar 1 ml de solução verde 0,1% de metilo a 99 ml da solução de soro fisiológico para colorir as contas transparente. Esta é a "solução injectável" verde metil 0,001%. Em seguida, adicionam-se 5 ml de solução a 0,1% verde de metilo a 45 ml de …

Representative Results

Os mosquitos que nem todos melanize os grânulos do mesmo modo, como algumas esferas foram cobertas com menos melanina do que outras (Figura 1). Na verdade, alguns grânulos permaneceu azul devido a uma falta de melanização, ao passo que outros foram completamente escuro (Figura 1). O valor melanização foi padronizado por interpolação linear para um valor entre 0 (o que corresponde a um cordão azul e unmelanized) e 100 (correspondendo a uma …

Discussion

Esta técnica de injeção é útil para estimular e estudar a resposta melanizacao em mosquitos. Por exemplo, aqui nós estudamos o efeito da carga de estímulos imunológico.

O passo crítico neste procedimento é adequada para inocular o mosquito. Qualquer dano excessivo aos músculos de vôo ou para o próprio mosquito pode impedir que o mosquito da alimentação ou podem matá-lo antes da dissecção. Um segundo passo fundamental é manter os mosquitos no gelo tempo suficiente para derr…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.

Materials

Microcapillary glass tubes GB120TF-10 science-products.com GB120TF-10 http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulb Drumond 1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beads Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany C25120 SIGMA need few to start
Methyl green Sigma-Aldrich 323829 ALDRICH need few to start
Software ImageJ opensource Version 1.47f7 or later
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Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Thomas, M. B., Koella, J. C. Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response. J. Vis. Exp. (119), e55013, doi:10.3791/55013 (2017).
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