inokulering<em> Anopheles gambiae</em> Myggor med pärlor för att inducera och mäta melanin Immune Response
Summary
Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.
Abstract
Stimulering av immunsvar är ett gemensamt verktyg i ryggradslösa studier för att undersöka effekt och mekanismerna för immunitet. Denna stimulering är baserad på injektionen av icke-patogena partiklar in insekter, eftersom partiklarna kommer att detekteras av immunsystemet och kommer att inducera produktionen av immuneffektorer. Vi fokuserar här på stimulering av melanin svar i mygga Anopheles gambiae. De melanin respons resulterar i inkapsling av främmande partiklar och parasiter med en mörk lager av melanin. För att stimulera detta svar är myggor ympades med pärlor i brösthålan med hjälp microcapillary glasrör. Sedan, efter 24 h, är myggor dissekeras för att hämta pärlorna. Graden av melanin av pärlan mäts med hjälp av bildanalysmjukvara. Pärlor inte har patogena effekterna av parasiter, eller deras förmåga att undvika eller undertrycka immunsvaret. Dessa injektioner är ett sätt att measure immun effektivitet och effekterna av immun stimuleringar på andra livshistoriekaraktärer, såsom fruktsamhet eller livslängd. Det är inte exakt samma som direkt studera värd-parasit interaktioner, men det är ett intressant verktyg för att studera immunitet och evolutionär ekologi.
Introduction
Insekter är beroende av immunsvar för att skydda sig mot parasiter och patogener 1 – 3 som bryter igenom deras nagelband eller deras midgut epitel 4. I myggor, dessa svar är effektiva mot bakterier 5, virus 6, filarial nematoder 7, och malariaparasiter 1,8,9. I myggor, är en viktig immunsvar inkapsling av främmande partiklar med melanin 10-12. Denna inkapsling kan hända i midgut eller i hemolymfa cirkulationssystemet 10-12. Denna melanin svar är ett resultat av den pro-fenoloxidas kaskad 10-12, och det kan leda till döden för parasiterna eller till deras fagocytos. Hos vuxna myggor, där antalet hemocyter celler är begränsad, är melanin ett humoralt svar, som mot Plasmodium parasiter eller filarial nematoder 7.I vissa andra insekter, är det direkt de hemocyter celler som samlas kring parasiten att melanize dem 7. Dessutom är melanin också viktigt för flera andra fysiologisk process som äggproduktion och nagelband sår läker 7.
Stimulering av immunsvar används som ett verktyg för att studera insekts immunitet i flera jordbruks- och folkhälsomodellsystem 13 – 18. Det används i Anopheles gambiae myggor, huvud vektor av malaria i Afrika, för att studera värd-parasit interaktioner 14 – 16,19. Dessa tekniker är baserade på förmågan hos insekter för att upptäcka parasiter med sina mönsterigenkänningsreceptorer (PRR) 2. Myggor kan också upptäcka andra molekyler som stör deras biologi såsom patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), eller upptäcka sina egna skadade celler på grund av frisättning av kollagen och nukleinsyror. Mygga immuncellers såsom de hemocyter används för detektion 20-23. De viktigaste immunsignalvägar är IMD Toll, JAK / STAT 24, och ribonukleinsyra interferens (RNAi) 25,26. Både Toll och IMD vägar påverkar melanin respons och interagera med pro-fenol kaskad 10-12.
Standardverktyget används för att stimulera melanin är ett inokulering av en mygga med en liten vulst i den hemolymfa av brösthålan. Graden av melanin inkapsling kan sedan mätas 19 efter att ha skaffat vulsten genom dissekering av mygga. I de flesta studier var bara en pärla injiceras per mygga 15,16,27, men injicera pärlor är möjligt för att studera gränserna för melanin svaret 19. Dessa pärlor injiceras med en injektionslösning (fysiologiskt serum) för att begränsa störning av mygga fysiologi ochuttorkningen av mygga 15,16,27. Ett färgämne sätts till denna lösning för att underlätta bead selektion. Det är samma för dissekering lösning som används för att hämta pärlan 15,16,27.
Fördelen med att ympa insekter med icke-patogena stimuli är förmågan att fokusera på den direkta effekten på immunsvaret. Det finns inga komplicerande effekter på grund av parasiten patogenicitet 28, immunosuppression 29-31, eller immun skatteflykt 31-34. Dessutom konsekvenserna av stimuli på andra livshistoriekaraktärer, såsom livslängd eller fruktsamhet, kan också studeras. Således kan forskare studera evolutionär ekologi kräver sådana verktyg 2,35,36. Till exempel, immun utmanade humlor har en förkortad livslängd i svält. Liknande negativa effekter av immun stimuli och installationer har observerats i olika ryggradslösa modeller, vilket ofta resulterar i en korter livslängd eller mindre reproduktiva framgång 13,27,37. Sådana studier kan utföras i varierande miljöer 2,4,38. Att stimulera immunitet är också av intresse för dem att fokusera direkt på immunpatologi 39,40.
Detta protokoll är baserad på ympning av pärlor med myggor för att stimulera melanin respons och direkt mäter mängden melanin. Detta möjliggör kvantitativ och kvalitativ studie av melanin respons i olika experimentella inställningar. Ett sådant verktyg kan utökas till stimuleringen av andra immunsvar, såsom antibakteriella svaret på värmedödade bakterier 41. Det kan också utföras i många ekologiska inställningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna injektionstekniken är användbar för att stimulera och studera melanin svaret i myggor. Till exempel, här studerade vi effekten av immunstimuli belastning.
Det kritiska steget i detta förfarande är att korrekt ympa mygga. Alla svåra skador på flygmuskler eller mygga själv kan förhindra mygga från utfodring eller kan döda den före dissekering. En andra nyckelsteg är att hålla myggor på is tillräckligt länge för att slå ut dem utan att döda dem. En liten behållare ko…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.
Materials
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
Referências
- Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52 (2006).
- Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology. Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).
- Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
- Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
- Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
- Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -. C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
- Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
- Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
- Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865 (2014).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).
- Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
- Moret, Y., Schmid-Hempel, P. . Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , 1166-1168 (2000).
- Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
- Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
- Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
- Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
- Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
- Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210 (2016).
- Lazzaro, B. P., Rolff, J. Danger, Microbes, and Homeostasis. Science. 332 (6025), 43-44 (2011).
- Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
- Michel, K., Kafatos, F. C. Mosquito immunity against Plasmodium. Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
- Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
- Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
- Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
- Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
- Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377 (2004).
- Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
- Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
- Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
- Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
- Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
- Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
- Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
- Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
- Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
- Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
- Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
- Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
- Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711 (2013).
- Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
- Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).
