Este protocolo descreve a geração reprodutível e fenotipagem de células T reguladoras humanas induzida (iTregs) a partir de células naive T CD4 + in vitro. Diferentes protocolos de indução de FOXP3 permitem o estudo de fenótipos específicos iTreg obtidos com os respectivos protocolos.
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Artigo de método
Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células T reguladoras (Tregs) são parte integrante da tolerância periférica, suprimindo reações imunes contra autoestruturas e, assim, prevenindo doenças autoimunes. Abordagens clínicas para transferir Tregs adotivamente, ou para esgotar Tregs no câncer, estão em andamento com primeiros resultados promissores.
Como o número de Tregs de ocorrência natural (nTregs) é muito limitado, estudar certas características de Treg usando Tregs induzidas in vitro (iTregs) pode ser vantajoso. Até o momento, o melhor, embora não absolutamente específico, marcador de proteína para delinear Tregs é o fator de transcrição FOXP3. Apesar da importância das Tregs incluírem papéis não redundantes das Tregs induzidas perifericamente, os protocolos para gerar iTregs são atualmente controversos, particularmente para células humanas. Este protocolo, portanto, descreve a diferenciação in vitro de iTregs CD4 + FOXP3 + humanos de células T virgens humanas usando uma variedade de fatores indutores de Treg (TGF-β mais IL-2 apenas, ou sua combinação com ácido retinóico, rapamicina ou butirato) em paralelo. Também descreve a fenotipagem dessas células por citometria de fluxo e qRT-PCR.
Esses protocolos resultam na expressão reprodutível de FOXP3 e outros genes de assinatura de Treg e permitem o estudo de mecanismos regulatórios gerais de FOXP3, bem como efeitos específicos do protocolo para delinear o impacto de certos fatores. Os iTregs podem ser utilizados para estudar vários aspectos fenotípicos, bem como mecanismos moleculares de indução de Treg. Estudos moleculares detalhados são facilitados por números de células relativamente grandes que podem ser obtidos.
Uma limitação para a aplicação de iTregs é a relativa instabilidade da expressão de FOXP3 nessas células em comparação com nTregs. As iTregs geradas por esses protocolos também podem ser usadas para ensaios funcionais, como o estudo de sua função supressora, na qual as iTregs induzidas por TGF-β mais ácido retinóico e rapamicina exibem atividade supressora superior. No entanto, a capacidade supressiva dos iTregs pode diferir dos nTregs e o uso de controles apropriados é crucial.
Introdução
As células T reguladoras CD25 + CD4 + FOXP3 + (Tregs) suprimir outras células do sistema imune e são mediadores críticos de tolerância periférica, prevenção da auto-imunidade e inflamação excessiva 1. A importância de Tregs é exemplificado pela doença humana síndrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia ligada ao X (IPEX), em que a perda de Tregs devido a mutações no `master' Treg factor de transcrição caixa de forkhead P3 (FOXP3) leva à doença auto-imune sistémica grave, letal em idade precoce. No entanto, Tregs agir como uma espada de dois gumes no sistema imunológico como eles também podem prejudicar a imunidade anti-tumor em determina....
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Protocolo
As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas de fresco a partir de doadores saudáveis anónimos de crostas inflamatórias comprados a partir do University Hospital Karolinska, Suécia. autorização de ética para os experimentos foi obtido a partir do Conselho Regional ética revisão em Estocolmo (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Suécia (número de aprovação: 2013 / 1458-1431 / 1).
1. t isolamento de células a partir de sangue periférico
- PBMC Isolamento
- Pré-lay 15 ml de meio de centrifugação de densidade de solução (tais como Ficoll) em tubos de 50 ml (5 tubos por buffy coat). Pré-aquec....
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Resultados
A Figura 1 mostra um esquema da montagem experimental. A Figura 2 mostra uma coloração controle de pureza representante para as células T CD4 + naïve magneticamente isoladas e nTregs.
F igura 3A mostra a citometria de fluxo estratégia de propagação e Figura 3B mostra FOXP3 representativa e CD25 citometria de fluxo colorações no dia 6 da cultura nas .......
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Discussão
O protocolo descrito permite a indução de CD4 humano robusta + FOXP3 + iTregs a partir de células T CD4 + naive humanas. Ele inclui um novo protocolo que descrevemos recentemente, usando uma combinação de TGF-β, ATRA e rapamicina, para a indução de iTregs com superiores in vitro a função supressora 22. Em comparação com outros protocolos publicados, outra vantagem é a indução de diferentes populações iTreg em paralelo por diferentes protocolos, o que permite a comparação directa dos efeito.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Nina Nagel é grata pela assistência técnica durante a gravação do vídeo e preparação experimental. Agradecemos a Eva-Maria Weiss pela ajuda com o protocolo de coloração intracelular FOXP3 e a Elisabeth Suri-Payer e Nina Oberle por estabelecer o protocolo de isolamento nTreg. Matilda Eriksson e Peri Noori são reconhecidas pela gestão laboratorial.
Financiamento: A.S. foi apoiado por uma bolsa Marie Curie Intra European no âmbito do 7º Programa-Quadro da Comunidade Europeia, da Fundação Dr. Åke Olsson e das fundações de pesquisa KI; A.S. e J.T. foram apoiados por uma bolsa CERIC (Centro de Excelência para Pesquisa em Inflamação e Doenças Car....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido retinóico totalmente trans | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |
| anit-humano Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |
| microesferas anti-CD25 humanas | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |
| anti-humano CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |
| anti-humano CD28 anticorpo, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |
| anticorpo CD3 humano, purificado por LEAF | Biolegend | 317315 | |
| CD45RA anti-humano, FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |
| clone PE CD45RO anti-humano UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |
| clone anti-CD4-PerCP humano SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |
| anti-CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |
| anti-humano CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, violeta brilhante 421 | BD Biosciences | 562743 clone | |
| anti-humano IFN-g FITC 4S. B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |
| Solução contendo Brefeldin A: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |
| kit de síntese de cDNA: SuperScript VILO(transcriptase reversa) Kit de síntese de cDNA | Invitrogen | 11754-250 | |
| Meio de centrifugação de densidade: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |
| DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |
| FBS, Invitrogen | 10082-147 | ||
| Corante de Viabilidade Fixável Inativado por Calor, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 ou 65-0865-18 | |
| Conjunto de tampão de coloração Foxp3 | eBioscience | 00-5523-00 | Cuidado: contém paraformaldeído. Também pode ser comprado em kit combinado com anticorpos; 77-5774-40 Conjunto de coloração anti-humana Foxp3 Clone APC: 236A/E7 Conjunto |
| GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamina) | Invitrogen | 35050-061 | |
| kit de isolamento de células T CD4 virgens humanas II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| Albumina sérica humana 50 g/L | Baxter | 1501057 | |
| Ionomicina de Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |
| Colunas MACS LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| mouse IgG1 K Controle de Isotipo APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |
| mouse IgG1 K Controle de Isotipo FITC 50 μ g | eBioscience | 11-4714-81 | |
| controle de isotipo IgG2a de camundongo, violeta brilhante 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |
| plástico pipetado Pasteur, embalado individualmente | Sarstedt | 86.1172.001 | |
| PMA Phorbol 12-miristato 13-acetato | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |
| Rapamicina | EMD (Merck) | 553210-100UG | |
| IL-2 humana recombinante, CF | R & D | 202-IL-050/CF | |
| Humano Recombinante TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |
| Kit de isolamento de RNA: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| RPMI 1640 Médio | Invitrogen | 72400-054 | |
| Butirato de sódio | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |
| Meio de cultura de células T: meio X-Vivo 15, com gentamicina+fenolvermelho | TaqMan Lonza | 04-418Q | |
| , FOXP3 (Melhor Cobertura) | do ensaio 4331182; | Applied Biosystems | Cuidado: contém paraformaldeído |
| TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Melhor Cobertura) | Applied Biosystems | 4351370; ID do ensaio: Hs04194366_g1 | Cuidado: contém paraformaldeído |
| Mistura mestre de expressão gênica TaqMan 4369514 | Applied Biosystems |
Referências
- Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
- DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the litera....
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Reimpressões e permissões
