La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti
Summary
Questo protocollo descrive la generazione riproducibile e fenotipizzazione delle cellule T regolatorie indotte umane (iTregs) dalle cellule naïve T CD4 + in vitro. Diversi protocolli per l'induzione FOXP3 permettono lo studio di specifici fenotipi iTreg ottenuti con rispettivi protocolli.
Abstract
Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes.
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human naïve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-β plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR.
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained.
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-β plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.
Introduction
Cellule T regolatorie CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) sopprimere le altre cellule del sistema immunitario e sono mediatori critici di tolleranza periferica, impedendo autoimmunità ed eccessiva infiammazione 1. L'importanza di Tregs è esemplificata dalla malattia umana sindrome immunodysregulation poliendocrinopatia enteropatia legata all'X (IPEX), in cui la perdita di Tregs a causa di mutazioni nel master' Treg fattore di trascrizione forkhead box P3 `(FOXP3) porta ad una grave malattia autoimmune sistemica, letale in tenera età. Tuttavia, Tregs agire come una spada a doppio taglio nel sistema immunitario in quanto possono anche ostacolare l'immunità anti-tumorale in alcune impostazioni 2. manipolazione terapeutica del numero e della funzione Treg è quindi soggetto a numerose indagini cliniche. Nel cancro, l'esaurimento delle Tregs può essere desiderabile e un certo successo degli approcci clinici incoraggia ulteriori ricerche 3. Nelle malattie autoimmuni e infiammatorie, in aggiunta agli effetti terapeutici di Tregs in sevemodelli di malattia del mouse RAL, recenti prove in-man di trasferimento adottivo Treg per prevenire graft- contro -host malattia (GvHD) 4-7 e per valutare la sicurezza nel trattamento del diabete di tipo 1 8 ha mostrato risultati molto promettenti.
Presenti in natura Tregs (nTregs) comprendono tTregs timiche-derivati e pTregs perifericamente indotte, con funzioni essenziali non ridondanti nel mantenimento della salute 9 – 11. Tuttavia, i numeri nTreg sono limitate, favorendo l'approccio complementare di indurre Tregs (iTregs) in vitro da precursori delle cellule T naive 12. Ancora stabilità iTregs, presumibilmente a causa della mancanza di demetilazione nella cosiddetta regione demetilato Treg-specifico (TSDR) nel locus genico FOXP3 13, rimane una preoccupazione e diversi studi indicano che in vivo indotto Tregs sono più stabili 14.
Fino ad oggi, FOXP3 rimane la migliore proteina mArker per Tregs ma non è assolutamente specifica perché convenzionali cellule CD4 + CD25- T umani transitoriamente esprimono livelli intermedi di FOXP3 all'attivazione 15,16. Anche se sono stati compiuti progressi significativi nel chiarire la regolazione dell'espressione FOXP3, resta molto da scoprire per quanto riguarda l'induzione, la stabilità e la funzione di FOXP3 in particolare nelle cellule umane. Nonostante le differenze a nTregs, in vitro indotta FOXP3 + cellule T CD4 + possono essere utilizzati come sistema modello per studiare i meccanismi molecolari dell'induzione FOXP3 e come punto di partenza per sviluppare protocolli in futuro che consentono la generazione di iTregs più simili al vIVO generato Tregs, che potrebbe essere applicabile per le strategie di trasferimento adottivo in futuro.
Non vi è alcun `protocollo d'oro standard' per indurre iTregs umani, e attuali protocolli sono stati sviluppati sulla base di mimare condizioni Treg-inducono in vivo: interleuchina 2 (IL-2) E fattore di crescita trasformante β (TGF-β) di segnalazione sono cruciali per l'induzione FOXP3 in vivo 17, e all-trans retinoico (ATRA) – che è prodotto in vivo dalle cellule dendritiche intestinali associate – viene spesso utilizzato per migliorare l'induzione FOXP3 in vitro 18 – 21. Abbiamo sviluppato ulteriori protocolli Treg-inducono umani utilizzando butirrato 22, un acido grasso a catena corta flora intestinale di derivazione che è stato recentemente dimostrato per aumentare murino Treg induzione 23,24. Abbiamo inoltre recentemente istituito un nuovo protocollo per la generazione di iTregs con funzione di soppressiva superiore in vitro utilizzando una combinazione di TGF-β, ATRA e rapamicina 22, quest'ultimo è un mammalian target clinicamente approvato rapamicina (mTOR) inibitore che è noto per la promozione manutenzione FOXP3 durante umana espansione Treg 25,26.
Questo metodo descrive la riproducibile devitro generazione di CD4 umana + FOXP3 + iTregs utilizzando una serie di condizioni diverse, e la loro successiva fenotipizzazione mediante citometria di flusso e la reazione quantitativa inversa a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) per rivelare i modelli specifici del protocollo di espressione di FOXP3 e altre molecole di firma Treg tali come CD25, CTLA-4, EOS, così come la repressione di IFN-γ e di espressione SATB1 22. Le popolazioni cellulari generati possono essere utilizzati per saggi funzionali relative attività soppressiva o per studi molecolari, né riguardo regolatori generali FOXP3 o per studiare gli effetti specifici di alcuni composti come butirrato o rapamicina. Ulteriore comprensione dei meccanismi molecolari di guida differenziazione Treg è molto importante per i futuri approcci terapeutici in autoimmunità o il cancro per indirizzare specificamente molecole coinvolte nella generazione e la funzione Treg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto consente l'induzione robusto di CD4 umana + FOXP3 + iTregs da cellule T CD4 + naive umane. Esso comprende un nuovo protocollo che abbiamo descritto recentemente, utilizzando una combinazione di TGF-β, ATRA e rapamicina, per l'induzione di iTregs con superior funzione in vitro soppressiva 22. Rispetto ad altri protocolli pubblicati, un altro vantaggio è l'induzione di diverse popolazioni iTreg in parallelo da diversi protocolli, che consente il confront…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management.
Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. Åke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.
Materials
| All-trans retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |||
| anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |||
| anti-human CD25 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |||
| anti-human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |||
| anti-human CD28 antibody, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |||
| anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |||
| anti-human CD45RA , FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |||
| anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |||
| anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |||
| anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |||
| anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 | BD Biosciences | 562743 | |||
| anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |||
| Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |||
| cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754-250 | |||
| Density centrifugation medium: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |||
| DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |||
| FBS, heat inactivated | Invitrogen | 10082-147 | |||
| Fixable Viability Dye, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 or 65-0865-18 | |||
| Foxp3 Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Caution, contains Paraformaldehyde Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set |
||
| GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Invitrogen | 35050-061 | |||
| human naive CD4 T cell isolation kit II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |||
|
|
130-094-131 | |||
| Human serum albumin 50 g/l | Baxter | 1501057 | |||
| Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |||
| MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |||
| mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |||
| mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 ug | eBioscience | 11-4714-81 | |||
| mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |||
| Pasteur pipet plastic, individually packed | Sarstedt | 86.1172.001 | |||
| PMA PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |||
| Rapamycin | EMD (Merck) | 553210-100UG | |||
| Recombinant Human IL-2, CF | R&D | 202-IL-050/CF | |||
| Recombinant Human TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |||
| RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |||
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 72400-054 | |||
| Sodium butyrate | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |||
| T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred | Lonza | 04-418Q | |||
| TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
| TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; assay ID: Hs04194366_g1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
| TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |
Referências
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