Bu protokol, in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir üretimi ve insan kaynaklı düzenleyici T hücrelerinin (iTregs) fenotipleme tarif eder. FoxP3 indüksiyonu için farklı protokoller ilgili protokolleri ile elde edilen spesifik iTreg fenotipleri çalışması için izin verir.
Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes.
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human naïve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-β plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR.
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained.
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-β plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.
CD4 + CD25 + FoxP3 + düzenleyici T hücreleri (Tregs) diğer bağışıklık hücrelerini bastırmak ve periferik tolerans kritik arabulucular, önlenmesi otoimmünite ve aşırı enflamasyon 1 bulunmaktadır. Tregs önemi, ciddi sistemik otoimmün hastalık yol açar Tregs kaybı nedeniyle `master' Treg transkripsiyon faktör forkhead kutusu P3 mutasyonlar insan hastalık immunodysregulation poliendokrinopati enteropatisi X'e bağlı sendromu (IPEX), (FoxP3) tarafından örneklenmiştir erken yaşta ölümcül. Ancak, Treg'ler onlar da bazı ayarlarda 2 anti-tümör bağışıklığını engel gibi bağışıklık sisteminde bir iki ucu keskin kılıç olarak hareket ederler. Treg sayısı ve fonksiyonu Terapötik manipülasyon birçok klinik araştırmalarda bu nedenle tabidir. Kanserinde Tregs tükenmesi arzu edilebilir ve klinik yaklaşımlar bazı başarı daha fazla araştırma 3 teşvik eder. Pek çok dil içinde Tregs terapötik etkilerine ek olarak, otoimmün ve enflamatuar hastalıkların, bölgesindekiral fare hastalık modelleri, evlatlık Treg transferi son ilk-man denemeleri greftleme karşı -host hastalığı (GVHH) 4 önlemek için – 7 ve çok umut verici sonuçlar vermiştir tip 1 diyabet 8 tedavisinde güvenliğini değerlendirmek için.
11 – Doğal Tregs (nTregs üretme) SAĞLIK 9 korunmasında yedeksiz temel fonksiyonları ile timik türevli tTregs ve periferik kaynaklı pTregs içermektedir meydana. Bununla birlikte, nTreg numaraları naif T hücresi öncüleri 12 in vitro olarak uyarılması Tregs (iTregs) tamamlayıcı bir yaklaşım teşvik sınırlıdır. Bunun nedeni, muhtemelen FoxP3 gen lokusu 13 olarak adlandırılan regülatör özgü demetile bölge (TSDR) 'de demetilasyon eksikliği iTregs Hala stabilite, bir sorun olmaya devam etmektedir ve birçok çalışma, Tregs bağlı in vivo 14 daha kararlı olduğunu göstermektedir.
Bugüne kadar, FoxP3 en iyi protein m kalırinsan geleneksel CD4 + CD25 T hücreleri geçici aktivasyon 15,16 üzerine FOXP3 orta düzeyde ifade çünkü Tregs için arker ama kesinlikle özel değildir. önemli bir ilerleme FoxP3 ekspresyonunun düzenlenmesi açıklık yapılmış olmasına rağmen, daha özel olarak, insan hücrelerinde FOXP3 indüklenmesi, kararlılık ve işlevi ile ilgili tespit edilmesi gerekmektedir. NTregs için farklılıklara rağmen, in vitro FoxP3 neden + CD4 + T hücreleri FoxP3 indüksiyon moleküler mekanizmaları incelemek için bir model sistem olarak da kullanılabilir ve daha benzer iTregs üretilmesine izin gelecek protokolleri geliştirmek için bir başlangıç noktası olarak gelecekte adaptif transfer stratejileri için geçerli olabilir oluşturulan Tregs, vivo.
Orada insan iTregs ikna etmek için hiçbir `altın standard' protokolü ve mevcut protokoller in vivo regülatör uyaran koşulları taklit dayalı geliştirilen edilmiştir: 2 (IL-2, interlökin) Ve transforme edici büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal vivo 17 FoxP3 indüksiyonu için çok önemli olan, ve all-trans retinoik asit (ATRA) – bağırsak ile ilişkili dendritik hücreler tarafından in vivo üretilen – sıkça FoxP3 arttırılması için kullanılır 21 – 18, in vitro olarak. Bu bütirat 22 en son sıçangil regülatör indüksiyon 23,24 artırdığı gösterilmiştir bağırsak Mikrobiyota türetilen kısa zincirli yağ asit kullanılarak ek insan regülatör T indükleyici protokolleri geliştirmiştir. Ayrıca son zamanlarda bu teşvik ettiği bilinir önleyicisi ikinci rapamisin (mTOR) klinik olarak kabul memeli hedefi olarak, TGF-p, ATRA bir kombinasyonu kullanılarak ve 22 rapamisin ile, in vitro olarak, üstün bastırma fonksiyonu ile iTregs üretimi için yeni bir protokol kurulan insan Treg genişleme 25,26 sırasında FoxP3 bakım.
Bu yöntem tekrarlanabilir açıklarinsan CD4 + FoxP3 + farklı olan bir dizi şartı ile iTregs ve akış sitometrisi ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyon ile daha sonra fenotipleme nitro nesil (qRT-PCR) FOXP3 sentezlenmesi ve diğer regülatör imza molekülleri, protokole özel desenler ortaya çıkarmak için CD25, CTLA-4, EOS, hem de IFN-y ve SATB1 ifade 22 baskı olarak. oluşturulan hücre popülasyonları, genel FoxP3 düzenleyicileri ile ilgili ya da bu tür butirat veya rapamisin gibi bazı bileşiklerin özel etkilerini incelemek için, ya baskılayıcı aktivitesi ile ilgili olarak, işlevsel tayinler için veya moleküler çalışmalar için de kullanılabilir. Treg farklılaşma sürüş moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması, özellikle Treg nesil ve fonksiyonunda yer alan molekülleri hedef otoimmünite veya kanser gelecekteki terapötik yaklaşımlara için büyük önem taşımaktadır.
Açıklanan protokol, insan CD4 + FoxP3 + insan naif CD4 + T hücrelerinden iTregs sağlam indüksiyon sağlar. Biz üstün in vitro baskılayıcı fonksiyonu 22 iTregs uyarılması için, TGF-p, ATRA ve rapamisin bir arada kullanarak, son zamanlarda açıklanan yeni bir protokol içerir. Diğer yayınlanmış protokollere göre, bir başka avantajı, tek başına IL-2 varlığında, aktive edilmiş olan kontrol hücreleri ile birlikte, belirli bir iTreg uyaran faktörlerin etkileri doğru…
The authors have nothing to disclose.
Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management.
Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. Åke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.
All-trans retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |||
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |||
anti-human CD25 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |||
anti-human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |||
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |||
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |||
anti-human CD45RA , FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |||
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |||
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |||
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |||
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 | BD Biosciences | 562743 | |||
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |||
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |||
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754-250 | |||
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |||
DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |||
FBS, heat inactivated | Invitrogen | 10082-147 | |||
Fixable Viability Dye, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 or 65-0865-18 | |||
Foxp3 Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Caution, contains Paraformaldehyde Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set |
||
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Invitrogen | 35050-061 | |||
human naive CD4 T cell isolation kit II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |||
![]()
|
![]()
|
130-094-131 | |||
Human serum albumin 50 g/l | Baxter | 1501057 | |||
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |||
MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 ug | eBioscience | 11-4714-81 | |||
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |||
Pasteur pipet plastic, individually packed | Sarstedt | 86.1172.001 | |||
PMA PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |||
Rapamycin | EMD (Merck) | 553210-100UG | |||
Recombinant Human IL-2, CF | R&D | 202-IL-050/CF | |||
Recombinant Human TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |||
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |||
RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 72400-054 | |||
Sodium butyrate | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |||
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred | Lonza | 04-418Q | |||
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; assay ID: Hs04194366_g1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |