Den nuværende protokol beskriver, hvordan Western blotting og immuncytokemi kombineret med hæmning af lysosomale enzymer kan bruges til at demonstrere nedregulering af ciliarneurotrofiske Factor receptor-α (CNTFRa), der transporteres af samspillet mellem Cytokine-lignende faktor-1 (CLF-1 ) og den endocytiske receptor sorLA.
Det heterodimere cytokin cardiotrophin-lignende Cytokine: Cytokin-lignende faktor-1 (CLC: CLF-1) er rettet mod glycosylphosphatidylinositol (GPI) -forankret CNTFRa for at danne et trimert kompleks, der efterfølgende rekrutter glycoprotein 130 / leukæmi inhibitorisk faktor receptor-β (gp130 / LIFRβ) til signalering. Både CLC og CNTFRa er nødvendige til signalering men hidtil CLF-1 har kun været kendt som en formodet formidler af CLC sekretion. Men er det for nylig blevet vist, at CLF-1 indeholder tre bindingssteder: en for CLC; én for CNTFRa (som kan fremme samling af trimere kompleks); og et for endocytiske receptor sorLA. Sidstnævnte site giver højaffinitetsbinding af CLF-1, CLC: CLF-1, såvel som det trimere (CLC: CLF-1: CNTFRa) kompleks til sorLA, og i sorLA-udtrykkende celler de opløselige ligander CLF-1 og CLC : CLF-1 hurtigt taget op og internaliseret. I celler co-udtrykkende CNTFRa og sorLA, CNTFRa først binder CLC: CLF-1 til dannelse afen membran-associeret trimert kompleks, men det forbinder også til sorLA via gratis sorLA-bindingssted i CLF-1. Som et resultat, CNTFRa, der har ikke plads til endocytose på sin egen, er trak sammen og internaliseret af sorLA endocytose af CLC: CLF-1.
Den nuværende protokol beskriver de eksperimentelle procedurer, der anvendes til at demonstrere i) sorLA-medierede og CLC: CLF-1-afhængige nedregulering af overfladen-membran CNTFRa udtryk; ii) sorLA endocytose og lysosomal målretning af CNTFRa; og iii) den sænkede cellulære respons på CLC: CLF-1-stimulation ved sorLA-medieret nedregulering af CNTFRa.
CLC og CLF-1 udgør de to underenheder af det heterodimere cytokin CLC: CLF-1 1-3. For cellulær signal induktion, CLC: CLF-1 første mål for CNTFRa, dens primære og GPI-forankret receptor, at danne en membran-bundne trimert kompleks. CLC: CLF-1: CNTFRa kompleks efterfølgende rekrutterer gp130 / LIFRβ der formidler transmembrane signalering via Janus-kinase / Signal transducere og aktivatorer af transskription 3 (JAK / STAT3) vej 4. Mus mangelfuld i nogen af de tre subunits viser en og samme fænotype og dør inden 24 timer efter fødslen på grund af et reduceret antal facial neuroner og utilstrækkelig diegivning 5-8. Resultaterne i mennesker ligeledes understrege funktionelle sammenhæng i de tre subunits. Således menneskelige mutationer (homozygote eller sammensatte) forårsager dysfunktion af CLC: CLF-1 eller CNTFRa, alle resultere i den såkaldte kolde-induceret svedtendens / Crisponi syndrom, en tilstand karakteriseret ved symptomer såsom impairød diegivning og synke, diverse dysmorfe funktioner, temperatur pigge, og paradoksalt og perfundere sveden ved lave temperaturer 9-11.
In vitro, kombinationen af CLC og CNTFRa er både nødvendige og tilstrækkelige for interaktion med gp130 / LIFRβ og induktionen af signalering i celler 12. Rolle CLF-1 på den anden side er mindre klar. Det er ikke direkte involveret i signalering, og har længe været betragtet som et appendiks, der primært tjener til at lette den cellulære sekretion af CLC 1. De seneste resultater viser, at CLF-1 har yderligere og mere vigtige funktioner implicerer både signal- og omsætning af CLC og CNTFRa. Det fremgår således, at CLF-1 indeholder tre uafhængige bindingssteder: en for sin velkendte binding til CLC; en, der medierer direkte binding til CNTFRa; og en tredje (høj affinitet) site for interaktion med endocytiske receptor sorLA. Som både CLC og CLF-1 synes & #160; at målrette CNTFRa med en betydelig lavere affinitet end CLC: CLF-1-kompleks, er det tænkeligt, at CLF-1 (via dets CNTFRa-bindingssted) fremmer forening CLC og CNTFRa og letter dermed signalering 13.
CLF-1 samspil med sorLA, det vigtigste spørgsmål af den nuværende præsentation, spiller en helt anden rolle. SorLA er en af de fem type 1 receptorer, der udgør Vps10p-domænet receptorfamilie 14. Det udtrykkes i en række væv, men navnlig i hjernen og neuronale væv 15. Svarende til de andre familiemedlemmer sorLA bærer en N-terminal ligand-binding Vps10p-domæne, men derudover den omfatter også andre domæne typer, herunder ligandbindende elementer, der findes i medlemmer af low-density lipoprotein receptor familie 15. Dens cytoplasmatiske hale interagerer med flere adapter proteiner, f.eks adapter protein-1 og -2, og sorLA formidler effektive endocytoser samt intracellulær sortering og transport af bundne proteiner 16-18. Den Vps10p-domænet består af en stor ti-bladet β-propel 19,20, der binder en række uafhængige ligander, herunder CLF-1 (men især, ikke CLC) 13. Bindingsstedet i CLF-1 er tilgængelig, selv efter kompleksdannelse med CLC og CNTFRa hvilket betyder, at sorLA binder ikke kun gratis CLF-1, men også CLC: CLF-1 og det trimere kompleks CLC: CLF-1: CNTFRa 13. SorLA formidler hurtig endocytose af CLF-1 og CLC: CLF-1, men disse er opløselige proteiner henviser CNTFRa er fastgjort til overfladen membran ved et GPI-anker. Spørgsmålet er derfor, om binding af CLC: CLF-1: CNTFRa tillader sorLA at internalisere hele komplekset og derved ændre overfladen-membran udtryk for CNTFRa (og den efterfølgende cellulære modtagelighed for CLC: CLF-1 signal induktion), og / eller omsætning CNTFRa.
Forsøgene beskrevet i den foreliggenderapport var designet til at afklare følgende spørgsmål:
Er sorLA mægle CLC: CLF-1-afhængige nedregulering af overfladen-membran CNTFRa? For at afklare dette, blev det i første omgang forsøgte at bestemme omsætningen af CNTFRa (i fravær og tilstedeværelse af sorLA) ved hjælp af metaboliske mærkning og pulse-chase eksperimenter som beskrevet i 21. Men forsøg på at mærke CNTFRa anvendelse af en blanding af [S 35] cystein og [S 35] methionin viste dårlig inkorporering af radioaktivitet. Dette antydede en meget lav grad af nye syntese, som efter al sandsynlighed vil være i stand til at kompensere for en pludselig og betydelig tab af receptorer. At afgøre, om CNTFRa blev nedreguleret, når forbundet med hinanden via CLC: CLF-1 til sorLA, blev det derfor besluttet blot at måle (ved hjælp af Western blotting) det samlede cellulære pulje af CNTFRa før og efter udsættelse for CLC: CLF-1 – og at sammenligne resultater i celler transficeret eller ej transficeret medsorLA.
Er sorLA målrette CNTFRa til lysosomer? For at besvare dette spørgsmål, lokalisering af CNTFRa – internaliseret via sin CLC: CLF-1-medieret binding til sorLA – blev undersøgt ved hjælp af immunocytokemi, og mærkning med antistoffer rettet mod CNTFRa og sene-endosomet / lysosomer markør Lysosomal-associerede Membrane Protein 1 (LAMP-1). Forsøget blev udført på celler behandlet samt ubehandlet med inhibitorer af lysosomale enzymer. Ideen var jo, at hvis CNTFRa blev nedbrudt i lysosomer, ville celler behandlet med enzym-hæmmere præsentere CNTFRa-farvning akkumulere i LAMP-1-positive vesikler, mens ubehandlede celler ville vise lidt eller ingen farvning for CNTFRa.
Er CNTFRa nedregulering sænke den cellulære respons på CLC: CLF-1 stimulation? Det trimere kompleks bestående af CLC, CLF-1, og CNTFRa signaler via gp130 / LIFRβ heterodimer hjælp af JAK / STAT3pathway. Følgelig kapaciteten af celler reagerer på CLC: CLF-1-signalering ved nedregulering af CNTFRa blev udforsket ved Western blot-påvisning og kvantificering af phospho-STAT3 (pSTAT3) / total STAT3 niveau i sorLA transfektanter.
Den her beskrevne protokol kan bruges specielt til at demonstrere sorLA-medierede CLC: CLF-1-afhængige nedregulering og lysosomale målretning af CNTFRa, samt den medfølgende svækket reaktion på CLC: CLF-1 stimulering.
Den HEK293 cellelinie er velegnet til denne protokol, da de har kun en mindre endogen udtryk for CNTFRa og sorLA, er nemme at transficere, udtrykke gp130 / LIFRβ, og har en stor celle krop, som er egnet til immuncytokemi. Men i teorien enhver cellelinie med lignende egenskaber skal arbejde så godt.
Protokollen har to kritiske trin. Den første vedrører trin 2.3, i hvilken leu / pep medium skal udskiftes cirka hver 6 timer i 24 timer. I modsat fald kan resultere i aktive lysosomale enzymer og mindre eller ingen påviselig ophobning af protein i lysosomerne. Den anden kritiske trin (3.4) bekymringer vask på pre-inkubation med CLC: CLF-1. Det er imtigt at fjerne eventuelt ubundet ligand, og tillade cellerne tid til at komme (undgå fortsatte stimulering) i ikke-suppleret DMEM (blank medium). Dette vil sikre et lavt baggrundsniveau af pSTAT3 under den efterfølgende restimulering med CLC: CLF-1 (trin 3.5).
Især Figur 6 viser, at den cellulære respons (pSTAT3) aftager parallelt med sorLA-medierede nedregulering af CNTFRa. Det skal understreges dog, at selv om en nedsat respons er i overensstemmelse med (og kan forventes ved) en reduktion af CNTFRa pool, betyder det ikke, at den lave CNTFRa ekspression tegner sig alene for den reducerede cellulære respons. Således ændringer – som følge af præ-stimulering eller transfektion – kan i nogen af de funktionelle elementer i signalvejen opstrøms til pSTAT3 have bidraget til den ændret respons.
Det grundlæggende koncept af protokollen er ikke begrænset til denne particular receptor system. (. Dvs. en anden cellelinie, andre antistoffer, andre ligander, etc.) ved at modificere protokol det kan bruges til at bestemme ligand-induceret nedregulering af andre receptorer samt – uanset sorLA's engagement. Det skal dog bemærkes, at analysen af receptor-nedregulering ved Western blotting hovedsagelig er velegnet til receptorer, fx GPI-forankrede receptorer, der udviser en langsom omsætning og en lav grad af ny syntese i ustimulerede celler. Således i receptorer udviser et højt niveau af nye-syntese, ligand-induceret nedregulering kan der kompenseres for ved syntese af nye receptorer. Under disse omstændigheder kan nedreguleringen af receptoren puljen i stedet bestemmes ved hjælp af metabolisk mærkning og pulse-chase forsøg som beskrevet i 21. Alternativt ioderede antistoffer (fortrinsvis Fc-fragmenter), som ikke interfererer med receptor-binding kan anvendes til at "mærke" ektodomænet af recepteller, og det forventede nedregulering kan derefter bestemmes ved radioaktiv tælling af cellepellet og medium.
Af logistiske årsager transficerede vi vores celler med et CNTFRa konstruktion bærer et Myc-tag, og i den foreliggende protokol en muse-anti-Myc-antistof blev anvendt til Western blot-påvisning af receptoren. I modsætning hertil blev et gede-anti-CNTFRa antistof, der anvendes til immunocytokemi og dobbelt mærkning som LAMP-1 blev påvist ved et muse-antistof – og naturligvis anvendelse af to primære museantistoffer ville resultere i uspecifik (overlappende) farvning med sekundære antistoffer. Bemærk, at eftersom gede-anti-CNTFRa også virker i Western blotting (ikke vist), protokollen kunne let modificeres og anvendes på celler transficeret med ukodet CNTFRa.
Endelig er det for nylig blevet vist, at også endocytiske receptor sortilin binder CLC: CLF-1 med høj affinitet 22. Det er således tænkeligt, at sortilin, ligesomsorLA, forbinder til CLC: CNTFRa via CLF-1 og er i stand til at mægle endocytose og lysosomal målretning af CNTFRa så godt. Brug sortilin stedet for sorLA, kan denne protokol bruges til at afklare dette spørgsmål.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
Saponin | Sigma | S7900-100G | |
Mounting Media | Dako | S3023 |