Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.
Abstract
For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.
Introduction
Yeme gereklidir; Bununla birlikte, bulimia, anoreksia ve kıldığını aşın yemesine genel eğilim gibi yeme bozuklukları ile sonuçlanır gıda alımının deregülasyonu bireyler ve toplum, 1, 2, 3 maliyeti. Bu araştırmanın amacı, gıda alımının düzenleyici mekanizmaların ortaya çıkarmak ve bozukluk oluşumunu engellemeyi için bir strateji sağlamaktır. Memeli model organizmalar kullanarak çok sayıda çalışmalar bozuklukları 4, 5, 6 yeme devresi ve sinyal sistemlerinin rolünün yeni anlayışlar sağladı. Bununla birlikte, bu bozuklukların altında yatan nöronal ve moleküler üsleri bilgimiz tam uzaktır. Son yıllarda, meyve Drosophila melanogaster metabolis düzenlenmesi, temel mekanik anlayışlar çözülüyor için değerli bir model sistem haline gelmiştir uçmakm 7, 8, 9. Drosophila melanogaster için kılcal besleyici (CAFE) deneyi blowfly 10, 11 DETHIER tarafından daha önceki bir çalışmadan esinlenerek 2007 yılında Seymour Benzer'in laboratuarda kurulmuştur. CAFE tahlil mümkün doğrudan Drosophila melanogaster gıda alımını ölçmek için yapılan. Bu davranışsal test sistemi, sinekler, bir şişeye içine yerleştirilen kademeli cam kılcal sağlanan sıvı gıdalarla beslenmesidir. Kılcal menisküsün düşüş buharlaşma ve gıda tüketimi yoluyla gıda çözümünün kaybını gösterir. sinekler olmadan şişeleri ile buharlaşma hızının belirlenmesi gıda alımının doğru ölçümü sağlar.
CAFE tahlil Drosophila melanogaster beslenme ölçmek için kullanılan çeşitli davranışsal paradigmalar biridir ve araştırmacılar kendi özel için en uygun olanı seçmek zorundasoru. Aşağıdaki noktaları göz önünde belirli bir tahlil kullanma kararı: sağlanan gıda doğasını; beslenme durumu; alımı veya besin alımı ve soruşturma gıda tüketimi veya gıda tepki ölçümü.
Bu raporda açıklanan şekilde CAFE tahlil dik besleme koşullarında bir sıvı gıda kaynağının gıda alımını takip için idealdir. Seçenek olarak gıda alımı, bir şişe içinde ya da plaka üzerinde renkli bir besin kaynağı bir uçucu grup için ölçülebilir. Sinekler normalde öldürülmüş ya da anestezi beslendikten sonra ve yutulur boya miktarı spektrometresi veya lekeli karın görsel muayene ile belirlenir edilir. Sinekler sadece 30 dk alımından sonra yutulur gıda salgılanmasını başlatmak, bu nedenle bu yaklaşım, sürekli uzun beslenme analizi için kullanımının zor 13, 12 davranışlar.
Buna karşılık sinekler zaman emilebilir boya bozulmadan tutulurRadyoaktif işaretleyicilerle s kullanılmış ve radyoizotopun tüketim bir parıldama sayacı 14, 15 puanlanmıştır. sinek sindirim sistemi tarafından radyoaktif emilimi uzun vadeli gıda alımı ölçümü mümkün kılan, ancak çünkü olmayan emilir ve atılır izleyici moleküllerinin tüketim küçümsemeye yol açabilir. Başka bir yaklaşım melanogaster normalde gıda alımının 16 oluşur hortum uzatma yanıtı (PER) 'dir Drosophilia'daki gıda tepkisini ölçmek için. Bu zarif yöntem bir gıda uyarana ilk tepkiyi ölçen ama alımının miktarını yazmaz. Gıda alımı dinamik besleme 17, 18 düzenlenmesi için önemli olan birkaç post-sindirim geribildirim sinyallerini kullanarak beslenme sırasında ayarlanır. Birçok deneme başına deneyinde yarı otomatikleştirmek veri toplama son yıllarda yapılmış <sclass = "xref"> 19, 20 kadar. Başına elektrik ped ya da elektrotların bir kombinasyonu ile tespit edilir ve bilgisayar aracılığı ile sayılır. Radyoizotop alımı ile PER tahlil birleştiren bu testte miktar beslenme farklılıklarını 18 tespit düşük hassasiyet ile sınırlı olduğunu ortaya çıkardı. Sinek cam kılcal el ile beslendiği elle besleme deneyi (MAFE) 21, en son tek hareketsiz sinek gıda alınmasının ölçümü için geliştirilmiştir. MAFE tahlil başlamanın toplayıcı ve beslenme müdahaleleri ortadan kaldırır ve PER bir zaman saniye çözünürlük ve inisiyasyon sahiptir ve gıda tüketimi deneyinde bağımsız izlenebilir. Ancak, yol hangi sineğin immobilizasyon (örneğin hareket, motivasyon) hala araştırılması gereken beslenme davranışının bazı yönlerini etkiler. Drosophila beni yiyecek tüketiminin ölçülmesi için farklı testlerin mükemmel karşılaştırmalı değerlendirme içinlanogaster ve en uygun olanı bulmakta araştırmacılara yardımcı Deshpande ve Marx tarafından raporlarını görmek için 13, 22.
CAFE deneyi, yukarıda tarif edilen diğer deneylerden dezavantajlarının bazılarının önler ve gıda alımının güvenilir ölçümler ile kullanım sadeliği birleştirir. Burada, CAFE tahlilinde ayrıntılı bir açıklaması temin edilmiştir ve buharlaşmayı azaltmak için basit bir ayar değişikliği göstermektedir. İki gıda seçimi deneyi (kısa ve uzun vadeli) ve sineklerin sakaroz alımı da dahil olmak üzere Temsilcisi sonuçlar gösterilmiştir. tartışmada biz CAFE tahlil gerçekleştirmek ve potansiyel sınırlamaları vurgulamak için alternatif yollar ile tarif edilen yöntem karşılaştırın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Raporda, teknik kurulum ve laboratuvarda başarılı performansına odaklanarak, bir adım-adım moda CAFE deneyi açıklamaktadır. Kolaylığından dolayı, bu deney aynı zamanda bir okul deney olarak eğitimsel kullanılabilir. Örnekler tahlil kısa ve uzun süreler (gün saat) üzerinde Drosophila melanogaster gıda algılama, tercih ve tüketim soruşturma izin verdiğini göstermektedir. CAFE tahlil gıda ve ilaç tüketimi, madde bağımlılığı, enerji dengesini ve beslenme 16</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the past and present members of the Scholz lab for discussion and Helga Döring for excellent technical support. We especially thank the members of the Biocenter workshop of the University of Cologne for their support and creativity. The work is supported by SFB 1340, SysMedAlc, and DAAD-Siemens.
Materials
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied | ||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x29 x18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer`s Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1200g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
Referências
- Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. How high are the costs of eating disorders – anorexia nervosa and bulimia nervosa – for German society. Eur. J. Health Econ. 3 (4), 244-250 (2002).
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity and instrumental variables approach. J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).
- The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC Available from: https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf (2015)
- Lenard, N. R., Berthoud, H. R. Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes. Obesity. 16, S11-S22 (2008).
- Magni, P., et al. Feeding behavior in mammals including humans. Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).
- Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. Neurobiology of food intake in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).
- Bharuchka, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism. Pediatr. Res. 65 (2), 132-137 (2009).
- Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. From fat fruit fly to human obesity. Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, (2013).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Dethier, V. G. . The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , (1976).
- Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila. Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat. Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods. J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).
- Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila. Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness. J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).
- Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila. J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), e101107 (2014).
- Itskov, P. M. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila. Nat. Commun. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol. Brain. 8, 87 (2015).
- Marx, V. Metabolism: feeding fruit flies. Nat. Methods. 12 (7), 609-612 (2015).
- Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr. Biol. 19 (24), 2126-2132 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value. Alcohol Clin. Exp. Res. 36 (11), 1903-1912 (2012).
- Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster. Curr. Biol. 20 (11), 1006-1011 (2010).
- Masek, P., Scott, K. Limited taste discrimination in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (33), 14833-14838 (2010).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior. Plos One. 9 (6), e99732 (2014).
