Drug behandling og<em> In vivo</em> Imaging af Osteoblast-osteoklaster Interaktioner i en Medaka Fish Osteoporose Model
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
Bone-dannende osteoblaster interagere med knogleresorberende osteoklaster til at koordinere omsætningen af knogle matrix og til at styre skelet homeostase. Medaka og zebrafisk larver er almindeligt anvendt til at analysere adfærden af knogleceller under knogledannelse, degeneration, og reparation. Deres optiske klarhed tillader visualisering af fluorescensmærkede knogleceller og fluorescerende farvestoffer bundet til mineraliserede skelet matrix. Vores laboratorium har genereret transgene Medaka fisk, der udtrykker osteoklast-inducerende faktor Receptor Activator of Nuclear-KB-ligand (RANKL) under kontrol af en varmechok-inducerbar promotor. Ektopisk ekspression af RANKL resulterer i overskydende dannelse af aktiverede osteoklaster, der kan visualiseres i reporter linjer med nlGFP ekspression under kontrol af den cathepsin K (ctsk) promotor. RANKL induktion og ektopisk osteoklastdannelse fører til svær osteoporose-lignende fænotyper. Forbindelse transgene Medaka liNes, der udtrykker ctsk: nlGFP i osteoklaster, samt mCherry under kontrol af den osterix (OSX) promotor i præmature osteoblaster, kan bruges til at studere interaktionen af begge celletyper. Dette letter in vivo observation af cellulær adfærd under betingelser med knoglenedbrydning og reparation. Her beskriver vi brugen af dette system til at teste et lægemiddel almindeligt anvendt i human osteoporose terapi og beskrive en protokol for direkte billedvisning. Den Medaka model supplerer studier i cellekultur og mus, og tilbyder en roman system til in vivo analyser af narkotika handling i skelettet.
Introduction
Den hvirveldyr skelet giver strukturel støtte og beskyttelse til organer, giver mobilitet, og tjener som en kilde til calcium. Gennem hele livet, er den ekstracellulære knoglematrix kontinuerligt vendes for at opretholde knoglen stabilitet og stivhed. Denne proces kræver stramt koordineret aktivitet og samspil af knogledannende osteoblaster og knogleresorberende osteoklaster. Osteoblaster er afledt fra multipotente mesenchymale stamceller og producere kollagen til dannelse af osteoid, det proteinholdige del af knoglematrix 10. Osteoblaster interagere med osteoklaster at opnå en afbalanceret aktivitet af begge celletyper, som er nødvendigt for at styre knogle homeostase 7. På grund af disse indviklede regulatoriske interaktioner, reaktioner på lægemiddelbehandling og knogle homeostase kan ikke fuldt undersøgt ved hjælp af in vitro-undersøgelser. Der er derfor et stort behov for dyremodeller. I forhold til indstillingerne for cellekultur, kan in vivo modeller giverværdifuld indsigt i de flercellede netværk i knoglen miljø.
Talrige musemodeller findes for en række humane knoglelidelser, herunder osteoporose 16. Men størrelsen og tilgængeligheden af museembryoer udgør betydelige begrænsninger for levende billeder af skelet processer. Lille benfisk, på den anden side, tjener som et attraktivt alternativ til in vivo-billeddannelse. Zebrafisk (Danio rerio) og Medaka (Oryzias latipes) er blevet populære dyremodeller for skelet forskning i de sidste to årtier 17, 19, 22, 24. Bone i benfisk og i pattedyr er meget ens, både på en strukturel og en fysiologisk niveau, og mange af de vigtigste regulatoriske gener og signalveje er bevaret 3. Som i pattedyr, benfisk omhyggeligt regulerer aktiviteten af osteoblaster og osteoklaster på balance knogledannelse og resorption 26. Vigtigst, optiske klarhed fish larver tillader brugen af fluorescerende reportere til at mærke knogleceller og forkalkede skelet matrixen 8, 9, 12, 21, 23, hvilket letter observation af cellulære processer i levende dyr. Desuden er en række genetiske værktøjer blevet genereret til at lette biomedicinsk relevant forskning i fisk. For Medaka især metoder til målrettet genmutation af CRISPR / Cas9 2, celle-slægt opsporing 6, og stedsspecifik transgenese 14 er for nylig blevet etableret og er nu almindeligt i brug 15.
Lille teleost larver med succes er blevet anvendt til kemiske skærme, som førte til opdagelsen af flere farmakologisk relevante lægemidler 1, 18.
Fiskelarver er tolerante over for lave koncentrationer af DMSO og er i stand til at absorbere forbindelser fra deres vandmiljø, enten gennem huden eller gennem mave-tarmkanalen 1, 5. Vores laboratorium tidligere reported transgene Medaka linjer, der udtrykker fluorescerende reportere i knogleceller under kontrol af forskellige osteoblast- og osteoclast-specifikke promotorer. Disse omfatter for tidligt fødte osteoblaster (kollagen 10a1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, modne osteoblaster (osteocalcin, OSC) 27, og osteoklaster (cathepsin K, ctsk) 24. Vi genererede også en transgen linie, der udtrykker osteoklast-inducerende faktor Receptor Activator of Nuclear-KB-ligand (RANKL) under kontrol af en varmechok-inducerbar promotor 24.
Induktion af RANKL i dette system resulterer i ektopisk dannelse af aktive osteoklaster. Dette fører til øget knogleresorption og en svær osteoporose-lignende fænotype, med drastisk reduceret mineralisering i hvirvellegemerne. Vi har for nylig vist, at osteoklastaktivitet i denne model kan blive blokeret af bisfosfonater etidronat og alendronat, two lægemidler, som normalt anvendes i human osteoporose terapi, derved valideret Medaka som et egnet modelsystem for osteoporose 27.
På grund af deres store kuld størrelse, hurtig udvikling, og lille størrelse af embryoner, transgene Medaka larver er unikt egnet til storstilet screening af osteoporose narkotika og til in vivo analyse af knogle celle adfærd. Studier i Medaka kan således effektivt supplere eksperimenter i cellekulturer og i mus, der er rettet mod at opdage nye terapeutiske mål og nye behandlingsformer for humane knoglelidelser.
I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en protokol til at behandle Medaka knogle-reporter larver med det fælles osteoporose narkotika, alendronat. Vi beskriver også i detaljer, hvordan behand- let larver er monteret og forberedt til direkte billedvisning af knoglematrix og knogleceller. Disse protokoller kan let tilpasses til andre små kemiske forbindelser, der enten arbejder som knogleanabolsk eller antiresorptive lægemidler. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Det er væsentligt, at betingelserne for varmechok behandling er konsistente og stabile, når man sammenligner forskellige prøver. Stabile temperaturforhold garanterer tilsvarende niveauer af RANKL induktion i transgene larver og dermed sammenlignelig osteoklastdannelse, hvilket kan bekræftes ved screening for ctsk: nlGFP ekspression. I sidste ende fører dette til en tilsvarende grad af induceret ektopisk knogleresorption og osteoporose-lignende læsioner…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af tilskud fra Singapore Undervisningsministeriet (MOE, tilskud nummer 2013-T2-2-126) og National Institute of Health, USA (NIH, tildele nummer 1R21AT008452-01A1). TY modtog en kandidat stipendium fra NUS Biologisk Institut. Vi takker konfokale enhed af NUS Center for Bioimaging Sciences (CBIS) for deres konstante støtte.
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
Referências
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O. Osteoclasts: more than ‘bone eaters. Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F. Cellular mechanisms of bone remodeling. Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genética. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
