दवा उपचार और<em> Vivo</em> एक Medaka मछली ऑस्टियोपोरोसिस मॉडल में अस्थिकोरक-अस्थिशोषक सहभागिता की इमेजिंग
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
बोन बनाने अस्थिकोरक अस्थि-resorbing अस्थिशोषकों के साथ बातचीत हड्डी मैट्रिक्स का कारोबार करने के लिए समन्वय और कंकाल homeostasis को नियंत्रित करने के। Medaka और zebrafish लार्वा को व्यापक रूप से हड्डी गठन, अध: पतन, और मरम्मत के दौरान अस्थि कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। उनके ऑप्टिकल स्पष्टता fluorescently लेबल अस्थि कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट रंगों mineralized कंकाल मैट्रिक्स के लिए बाध्य के दृश्य के लिए अनुमति देता है। हमारी प्रयोगशाला ट्रांसजेनिक medaka मछली है कि एक गर्मी सदमे inducible प्रमोटर के नियंत्रण में अस्थिशोषक उत्प्रेरण कारक परमाणु कारक κB ligand (RANKL) के रिसेप्टर उत्प्रेरक का इजहार उत्पन्न किया है। सक्रिय अस्थिशोषकों, जो cathepsin कश्मीर (ctsk) प्रमोटर के नियंत्रण में nlGFP अभिव्यक्ति के साथ संवाददाता लाइनों में देखे जा सकते हैं से अधिक गठन में RANKL परिणामों के अस्थानिक अभिव्यक्ति। RANKL प्रेरण और अस्थानिक अस्थिशोषक गठन गंभीर ऑस्टियोपोरोसिस की तरह phenotypes की ओर जाता है। यौगिक ट्रांसजेनिक medaka लीएनईएस कि ctsk एक्सप्रेस: nlGFP अस्थिशोषकों, साथ ही समय से पहले अस्थिकोरक में osterix (OSX) प्रमोटर के नियंत्रण में mCherry में, दोनों प्रकार की कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह हड्डी अध: पतन और मरम्मत की शर्तों के तहत सेलुलर व्यवहार के vivo अवलोकन की सुविधा। यहाँ, हम आमतौर पर मानव हड्डियों की कमजोरी के उपचार में इस्तेमाल एक दवा परीक्षण और लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए इस प्रणाली के उपयोग का वर्णन। Medaka मॉडल सेल संस्कृति और चूहों में पढ़ाई के पूरक है, और कंकाल प्रणाली में दवा कार्रवाई के vivo विश्लेषण के लिए एक उपन्यास प्रणाली प्रदान करता है।
Introduction
कशेरुकी कंकाल, संरचनात्मक समर्थन और अंगों के लिए सुरक्षा प्रदान करता है गतिशीलता की अनुमति देता है, और कैल्शियम का एक स्रोत के रूप में कार्य करता है। जीवन के दौरान, बाह्य मैट्रिक्स हड्डी लगातार खत्म कर दिया है हड्डी स्थिरता और कठोरता को बनाए रखने के लिए। इस प्रक्रिया को कसकर समन्वित गतिविधि और बोन बनाने अस्थिकोरक और हड्डी resorbing अस्थिशोषकों की परस्पर क्रिया की आवश्यकता है। अस्थिकोरक multipotent mesenchymal progenitors से ली गई है और osteoid, हड्डी मैट्रिक्स 10 के प्रोटीन हिस्से के रूप में कोलेजन का उत्पादन कर रहे हैं। अस्थिकोरक अस्थिशोषकों के साथ बातचीत दोनों प्रकार की कोशिकाओं, जो हड्डी homeostasis 7 को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है की एक संतुलित गतिविधि को प्राप्त करने के लिए। क्योंकि इन जटिल नियामक बातचीत की, नशीली दवाओं के उपचार और हड्डी homeostasis के लिए प्रतिक्रियाओं को पूरी तरह से इन विट्रो अध्ययन में उपयोग कर जांच नहीं की जा सकती। इसलिए, वहाँ पशु मॉडल के लिए एक मजबूत मांग है। सेल संस्कृति सेटिंग्स की तुलना में, विवो मॉडल में प्रदान कर सकते हैंहड्डी वातावरण में बहुकोशिकीय नेटवर्क में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि।
कई माउस मॉडल ऑस्टियोपोरोसिस 16 सहित मानव हड्डी विकारों की एक किस्म के लिए मौजूद हैं। हालांकि, आकार और माउस भ्रूण की पहुंच कंकाल की प्रक्रियाओं का जीना इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। छोटे Teleost मछली, दूसरे हाथ पर, vivo इमेजिंग के लिए एक आकर्षक विकल्प के रूप में सेवा करते हैं। Zebrafish (Danio rerio) और medaka (Oryzias latipes) पिछले दो दशकों के 17, 19, 22, 24 से अधिक कंकाल अनुसंधान के लिए लोकप्रिय पशु मॉडल बन गए हैं। Teleost मछली में और स्तनधारियों में हड्डी एक संरचनात्मक पर और एक शारीरिक स्तर पर दोनों बहुत समान है, और मुख्य नियामक जीन और संकेत रास्ते में से कई 3 संरक्षित कर रहे हैं। स्तनधारियों में के रूप में, Teleost मछली ध्यान से अस्थिकोरक और अस्थिशोषकों हड्डी गठन और अवशोषण 26 को संतुलित करने की गतिविधि को विनियमित। सबसे महत्वपूर्ण बात, फाई की ऑप्टिकल स्पष्टताश लार्वा फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग अस्थि कोशिकाओं और calcified कंकाल मैट्रिक्स 8, 9, 12, 21, 23, जो जीवित जानवरों में सेलुलर प्रक्रियाओं के अवलोकन की सुविधा लेबल करने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, आनुवंशिक उपकरणों की एक श्रृंखला मछली में biomedically प्रासंगिक अनुसंधान की सुविधा के लिए उत्पन्न किया गया है। विशेष रूप से medaka, CrispR / Cas9 2, सेल वंश 6 ट्रेसिंग, और साइट विशेष transgenesis 14 हाल ही में स्थापित किया गया है और व्यापक रूप से इस्तेमाल के 15 में अब कर रहे हैं द्वारा लक्षित जीन उत्परिवर्तन के लिए तरीके के लिए।
छोटे teleost लार्वा सफलतापूर्वक रासायनिक स्क्रीन है, जो कई औषधीय प्रासंगिक दवाओं 1, 18 की खोज के लिए नेतृत्व के लिए इस्तेमाल किया गया है।
मछली के लार्वा DMSO की कम मात्रा के सहिष्णु हैं और उनके जलीय वातावरण से यौगिकों को अवशोषित करने के लिए या तो त्वचा के माध्यम से या जठरांत्र पथ 1, 5 के माध्यम से कर रहे हैं। हमारी प्रयोगशाला पहले से प्रतिनिधिorted ट्रांसजेनिक medaka लाइनों है कि विभिन्न osteoblast- और अस्थिशोषक-विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में अस्थि कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से व्यक्त करते हैं। 20, 21, परिपक्व अस्थिकोरक (osteocalcin, ओएससी), 27, और अस्थिशोषकों (cathepsin कश्मीर, ctsk) 24; ये समय से पहले अस्थिकोरक (osterix, OSX कोलेजन 10a1, col10a1) शामिल हैं। हम यह भी एक ट्रांसजेनिक लाइन है कि एक गर्मी सदमे inducible प्रमोटर 24 के नियंत्रण में अस्थिशोषक उत्प्रेरण कारक परमाणु कारक κB ligand (RANKL) के रिसेप्टर उत्प्रेरक व्यक्त उत्पन्न।
इस प्रणाली में RANKL की प्रेरण सक्रिय अस्थिशोषकों के अस्थानिक गठन में यह परिणाम है। इस वृद्धि की हड्डी अवशोषण और एक गंभीर ऑस्टियोपोरोसिस की तरह phenotype की ओर जाता है, कशेरुका निकायों में काफी कम खनिज के साथ। हमने हाल ही में पता चला है कि इस मॉडल में अस्थिशोषक गतिविधि बिसफ़ॉस्फ़ोनेट्स etidronate और alendronate, tw द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता हैओ दवाओं सामान्यतः मानव हड्डियों की कमजोरी के उपचार में इस्तेमाल किया, इस प्रकार ऑस्टियोपोरोसिस 27 के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली के रूप में मान्य medaka।
उनकी एक बड़ी चिंता का आकार तेजी से विकास, और भ्रूण के छोटे आकार के कारण, ट्रांसजेनिक medaka लार्वा अनोखे ऑस्टियोपोरोसिस की दवाओं की बड़े पैमाने पर जांच के लिए और हड्डी सेल व्यवहार के vivo विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं। medaka में अध्ययन इस प्रकार कुशलता सेल संस्कृतियों में और चूहों कि मानव हड्डी विकारों के लिए नई चिकित्सकीय लक्ष्य और उपन्यास के उपचारों की खोज करने के उद्देश्य से कर रहे हैं में प्रयोगों के पूरक कर सकते हैं।
वर्तमान अध्ययन में, हम आम ऑस्टियोपोरोसिस दवा, alendronate साथ medaka हड्डी संवाददाता लार्वा के इलाज के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम यह भी विस्तार से वर्णन कैसे इलाज किया लार्वा घुड़सवार और हड्डी मैट्रिक्स और अस्थि कोशिकाओं का जीना इमेजिंग के लिए तैयार हैं। इन प्रोटोकॉल आसानी से अन्य छोटे रासायनिक यौगिकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि हड्डी उपचय या antiresorptive दवाओं के रूप में या तो काम करते हैं। </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
यह आवश्यक है जब विभिन्न नमूनों की तुलना गर्मी झटका उपचार के लिए परिस्थितियों के अनुरूप और स्थिर हैं। स्थिर तापमान की स्थिति ट्रांसजेनिक लार्वा में RANKL प्रेर…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना पर शिक्षा के सिंगापुर मंत्रालय (मो, अनुदान संख्या 2013-T2-2-126) और स्वास्थ्य, संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थान (एनआईएच, संख्या 1R21AT008452-01A1 अनुदान) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया। TY बायोलॉजिकल साइंसेज के एनयूएस विभाग से स्नातक छात्रवृत्ति प्राप्त की। हम उनके निरंतर समर्थन के लिए Bioimaging विज्ञान के लिए एनयूएस केंद्र (CBIS) के confocal इकाई धन्यवाद।
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
Referências
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