İlaç Tedavi ve<em> İn Vivo</em> Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
osteoblastlar kemik matriksinin ciro koordine etmek kemik rezorbe osteoklast ile etkileşim ve iskelet homeostazı kontrol etmek için kemik oluşturan. Medaka ve Zebra balığı larvaları yaygın kemik oluşumu, dejenerasyon ve onarım sırasında kemik hücrelerinin davranışını analiz etmek için kullanılır. Optik netlik floresan etiketli kemik hücreleri ve mineralli iskelet matrise bağlı floresan boyalar görselleştirme sağlar. Bizim laboratuvar bir ısı şoku ile uyarılabilir promoterinin kontrolü altında osteoklast başlatıcı faktör Nükleer faktör kB Ligand (RANKL) reseptör Aktivatör transgen Medaka balık üretti. Katepsin K (ctsk) promoterinin kontrolü altında nlGFP ifadesi ile raportör çizgilerle görüntülenmiştir Aktive edilmiş osteoklastlar, aşırı oluşumuna RANKL sonuçları ektopik ekspresyonu. RANKL indüksiyon ve ektopik osteoklast oluşumunu şiddetli osteoporoz gibi fenotipleri yol açar. Bileşik transgenik Medaka lictsk ifade Nes: nlGFP erken osteoblastlarda Osterix (OS X) promoterinin kontrolü altında osteoklastlar, hem de mCherry, her iki hücre tipinde etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Bu kemik erimesi ve onarım koşulları altında hücresel davranış in vivo gözlem kolaylaştırır. Burada, genel olarak, insan osteoporoz tedavisinde kullanılan bir ilaç test etme ve canlı görüntüleme için bir protokol tanımlamak için bu sistemin kullanımını tarif eder. Medaka modeli hücre kültürü ve farelerde çalışmaları tamamlar ve iskelet sisteminde ilaç etkisinin in vivo analizi için yeni bir sistem sunmaktadır.
Introduction
omurgalı iskelet, organlar için yapısal destek ve koruma sağlayan hareketlilik sağlar ve kalsiyum kaynağı olarak hizmet vermektedir. hayatı boyunca, hücre dışı matriks kemik sürekli kemik istikrar ve sertliği korumak için ters çevrilir. Bu işlem, sıkı bir şekilde koordine aktivitesi ve kemik oluşturan osteoblastların ve kemik erimesi ile ilgili osteoklastı etkileşimi gerektirir. Osteoblastlar multipotent mezenkimal atalarıdır türetilen ve osteoid, kemik matrisinin 10 proteinli kısmını oluşturmak üzere kolajen üretimini edilir. Osteoblastlar kemik homeostazı 7 kontrol etmek için gerekli olan hücre tipleri, her ikisi de dengeli bir etkinlik elde etmek osteoklastlar ile etkileşim. Çünkü bu karmaşık düzenleyici etkileşimlerin, ilaç tedavisi ve kemik homeostazı yanıtları tam in vitro çalışmalar kullanılarak incelenebilir edilemez. Bu nedenle, hayvan modellerinde güçlü bir talep vardır. Hücre kültürü ayarlarına göre, in vivo modellerde sağlayabilirKemik ortamında çok hücreli ağlar değerli bir fikir.
Çok sayıda fare modelleri, osteoporoz 16 de dahil olmak üzere, insan kemik bozukluklarının çeşitli ana kadar. Ancak, büyüklüğü ve fare embriyoları erişilebilirliği iskelet süreçlerin canlı görüntüleme için önemli sınırlamalar temsil etmektedir. Küçük Teleost balık, diğer yandan, in vivo görüntüleme için cazip bir alternatif olarak hizmet eder. Balığı (Danio rerio) ve Medaka (Oryzias latipes) son yirmi yıl 17, 19, 22, 24 üzerindeki kemik araştırma için popüler bir hayvan modelleri haline gelmiştir. Teleost balıklarda ve memelilerde kemik yapısal ve fizyolojik bir seviyede hem de çok benzer ve kilit düzenleyici gen ve sinyal yollarının çok 3 muhafaza edilir. Memelilerde gibi teleost balık dikkatle osteoblast ve kemik oluşumunu ve erimesini 26 denge osteoklastların aktivitesi düzenler. fi En önemlisi, optik netlikSH larva, kemik hücreleri ve canlı bir hayvanda hücresel süreçlerin 'in gözlemlenmesini kolaylaştırmaktadır kalsifiye iskelet matris 8, 9, 12, 21, 23, etiket, floresan muhabir kullanımına izin verir. Buna ek olarak, genetik bir dizi araç balık biyo-medikal ilgili araştırmaları kolaylaştırmak için oluşturuldu. Özellikle Medaka, CRISPR / Cas9 2, 6 izleme hücre soy ve site-spesifik transgenesis 14 yeni kurulan ve yaygın kullanımda 15 şimdi edilmiş hedeflenen gen mutasyonuna yöntemleri için.
Küçük Teleost larvaları başarıyla birkaç farmakolojik olarak ilgili ilaç 1, 18 keşfine yol kimyasal ekranlar için kullanılmıştır.
Balık larvaları DMSO düşük konsantrasyonlarına dayanıklı ve deriden veya mide-bağırsak, 1 ile 5 arasındaki, ya da su ortamında gelen bileşikleri emebilmektedir. Bizim laboratuvar önceden temsilcisiÇeşitli osteoblast- ve osteoklast özgü promoterlerin kontrolü altında, kemik hücrelerinde floresan haberci ifade orted transjenik Medaka hatları. 20, 21, olgun osteoblast (osteokalsin, OSC) 27 ve osteoklastlar (katepsin K ctsk) 24; bu erken osteoblast (Osterix, OS X kollajen 10a1, col10a1) içerir. Ayrıca, bir ısı şoku ile uyarılabilir promoterinin 24 kontrolü altında osteoklast başlatıcı faktör Nükleer faktör kB Ligand (RANKL) reseptör Aktivatör eksprese eden bir transgen doğru oluşturulur.
Bu sistemde RANKL endüksiyonu aktif osteoklastlar ektopik oluşumu ile sonuçlanır. Bu omur gövdelerinde büyük ölçüde azalır mineralizasyon ile, artmış kemik rezorpsiyonu ve şiddetli osteoporoz gibi fenotipe yol açar. Biz son zamanlarda bu modelde osteoklast aktivitesi bifosfonatlar Etidronate ve alendronat, tw tarafından bloke edilebilir olduğunu gösterdigenel olarak, insan osteoporoz tedavisinde kullanılan O ilaçlar, bu şekilde osteoporoz 27 için uygun bir model sistem olarak Medaka'nın doğrulanması.
Büyük olması nedeniyle kuluçka boyutu, hızlı gelişme ve embriyo küçük boyutu, transjenik Medaka larva osteoporoz ilaçların büyük ölçekli tarama ve kemik hücre davranış in vivo analizler için çok uygun olan. Medaka çalışmalar, böylece etkili bir şekilde hücre kültürlerinde ve insan kemik bozuklukları için yeni terapötik hedefler ve yeni tedavilerin keşfetmek amaçlayan farelerde deneyler tamamlayabilir.
Bu çalışmada, ortak osteoporoz ilaç, alendronat ile Medaka kemik muhabir larva tedavisi için bir protokol açıklar. monte edilir ve kemik matriks ve kemik hücrelerinin canlı görüntüleme için hazırlanmıştır nasıl tedavi larvaları Biz de ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu protokoller kolayca diğer küçük kimyasal bileşiklere adapte edilebilir kemik anabolik veya anti-emici ilaç olarak ya da iş. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
Farklı numunelerin karşılaştırırken ısı şoku muamelesinden koşulları tutarlı ve stabil olması esastır. Sabit sıcaklık koşullarında, ctsk taranması doğrulanabilir Sonuç olarak, benzer osteoklast formasyonunu transgenik larvalarda RANKL indüksiyon benzer seviyelerde garanti eder ve: nlGFP ifade. Son olarak, bu ALC boyama ile doğrulanmış olarak indüklenen ektopik kemik erimesi, osteoporoz gibi lezyonlar benzer derecede olur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Milli Eğitim Singapur Bakanlığı (MEB, hibe numarası 2013-T2-2-126) ve Sağlık, ABD Ulusal Enstitüsü (NIH, numara 1R21AT008452-01A1 hibe) hibe ile finanse edildi. TY Biyolojik Bilimler NUS Bölümü'nden mezun burs aldı. Biz onların sürekli destek için Biyogörüntüleme Bilimleri NUS Merkezi (CBIS) konfokal birimi teşekkür ederim.
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
Referências
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O. Osteoclasts: more than ‘bone eaters. Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F. Cellular mechanisms of bone remodeling. Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genética. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
