Imagens ao vivo para estudar microtúbulos instabilidade dinâmica em cancros da mama resistentes a taxano

Resumo

Neste artigo, relatamos um protocolo que descreve um método in vivo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes ao docetaxel (MCF-7_TXT). Neste método, um sistema de imagem de microscopia de deconvolução é usado para detectar a expressão de GFP-tubulina em células-alvo.

Resumo

Taxanos como o docetaxel pertencem a um grupo de agentes direcionados aos microtúbulos (MTAs) que são comumente usados para tratar o câncer. No entanto, a resistência ao taxano em células cancerígenas reduz drasticamente a eficácia do uso a longo prazo dos medicamentos. Evidências acumuladas sugerem que os mecanismos subjacentes à resistência ao taxano incluem mecanismos gerais, como o desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas devido à superexpressão de proteínas de efluxo de drogas, e mecanismos específicos de taxano, como aqueles que envolvem a dinâmica dos microtúbulos.

Como os taxanos têm como alvo os microtúbulos celulares, medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos é uma etapa importante na determinação dos mecanismos de resistência ao taxano e fornece informações sobre como superar essa resistência. No experimento, um método in vivo foi usado para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos. A α-tubulina marcada com GFP foi expressa e incorporada em microtúbulos em células MCF-7, permitindo o registro da dinâmica dos microtúbulos por lapso de tempo usando uma câmera sensível. Os resultados mostraram que, ao contrário das células_{MCF-7 CC} parentais não resistentes, a dinâmica dos microtúbulos das células_{MCF-7 TXT} resistentes ao docetaxel é insensível ao tratamento com docetaxel, o que causa a resistência à parada mitótica e apoptose induzida pelo docetaxel. Este artigo descreverá este método in vivo de medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos.

Introdução

A principal causa de mortalidade por câncer de mama é através de metástases ^{1, 2.} Os taxanos, como o docetaxel e o paclitaxel, são actualmente utilizados como esquemas de primeira linha para o tratamento de cancro da mama metastático ^{2, 3, 4, 5, 6.} Eles fazem parte de um grupo de agentes de metas de microtúbulos (MTA) que interrompem a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, um dos maiores desafios para a utilização em terapia curativa taxanos....

Protocolo

1. Preparar as células for Imaging ao vivo

1. Cultura de células e sementeira
   1. Utilização de células MCF-7 de cancro da mama seleccionados para resistência ao docetaxel (MCF-7 _TXT) e sua linha celular parental não resistente (MCF-7 _CC). O processo de selecção detalhada e a caracterização destas linhas celulares seleccionadas foram descritos anteriormente ^24.
   2. Cresça todas as células em placas de cultura de 10 cm a 37 ° C num meio composto de 90% de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e 10% de soro fetal de bovino (FBS) e suplementado com aminoácidos não-essenciais. Manter....

Resultados

Usando o protocolo aqui apresentado, foram estudados os efeitos do docetaxel sobre a dinâmica dos microtúbulos de (MCF-7) _TXT células cancerosas de mama normal (MCF-7 _CC) e docetaxel-resistente. Dois conjuntos de imagens mostram os efeitos do docetaxel (0,5 ^ M) sobre o crescimento e encurtamento dos microtúbulos em células MCF-7 _CC e MCF-7 _TXT células (Figura 1A).

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Discussão

Existem dois métodos principais para medir instabilidade dinâmica dos microtúbulos: in vitro e in vivo. No método in vitro, tubulina purificada é usada para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos com microscopia de contraste de interferência diferencial-lapso de tempo melhorado-computador. No método in vivo, microinjectados tubulina fluorescente, ou expressaram a GFP-tubulina, é incorporado em microtúbulos. A dinâmica (crescimento e encurtamento) dos microtúbulos é então grav.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Aminoácidos não essenciais	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM fenol vermelho-livre	Gibco, Invitrogen	21063
Reagente de CellLight *BacMam 2.0* GFP-tubulin	ThermoFisher Scientific	C10613	Reagente chave para expressar tubulina de GFP em células
Reagente de CellLight *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Controle
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	para dissolver decetaxel
22-mm coveslip de vidro	Fisher Scientifics	12-545-101
Placa de cultura de 6 poços	Greiner Bio-One International		cultura Celi de 6 poços
DeltaVision Microscopy Imaging Systems	GE Health		Este sistema está equipado com estação meteorológica para controle de temperatura e CO2. Também é equipado com o software Worx para controle de deconvolução e lapso de tempo.
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	ThermoFisher Scientific	25200056
conjunto de hemactómetros de linha brilhante, Hausser Scientific	Hausser Scientific, distribuído pela VWR	N.º do fornecedor: 1492 N.º da VWR:15170-172

Placa de