في الموقع الكشف والتحديد الكمي خلية مفردة لجسيمات نانوية أكسيد المعدن باستخدام تحليل ميكروبروبي النووية
Summary
يصف لنا إجراء للكشف عن هذا الموقع في العناصر الكيميائية في الخلايا البشرية، فضلا عن تقديرها في المختبر . الطريقة مناسبة تماما لأي نوع من الخلايا ومفيد بشكل خاص للتحاليل الكيميائية الكمية في الخلايا المفردة التالية في المختبر أكسيد المعدن جسيمات نانوية التعرض.
Abstract
تمكين التقنيات التحليلية الدقيقة استناداً إلى تصوير عنصر كيميائي التعريب والتحديد الكمي للتركيب الكيميائي على المستوى الخلوي. أنها تتيح إمكانيات جديدة لتوصيف نظم المعيشة وهي مناسبة خاصة لكشف، وإضفاء الطابع المحلي والتحديد الكمي لوجود جسيمات نانوية أكسيد المعدن في العينات البيولوجية والبيئة على حد سواء. في الواقع، هذه التقنيات جميع المتطلبات ذات الصلة من حيث (ط) الحساسية (من 1 حتى 10 µg.g-1 من وزن جاف)، (ثانيا) ميكرومتر نطاق القرار المكانية، والكشف عن (ثالثا) متعددة العناصر. ونظرا لهذه الخصائص، ميكروبيم تصوير عنصر كيميائي يمكن قوة تكمل تقنيات التصوير الروتينية مثل بصري والفحص المجهري الأسفار. ويصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحليل ميكروبروبي نووية في الخلايا المستزرعة (U2OS) تتعرض لجسيمات نانوية ثاني أكسيد التيتانيوم. يجب أن تنمو خلايا ويتعرض مباشرة في حامل مصممة خصيصا عينة المستخدمة في المجهر الضوئي وفي مراحل التحليل ميكروبروبي النووية. يحفظ تثبيت العينات المبردة يغرق-تجميد المنظمة الخلوية وتوزيع العناصر الكيميائية. تحليل ميكروبروبي النووية المتزامنة (أيون مجهر مسح وقياس الطيف الكتلي backscattering رذرفورد والجسيمات الناجمة عن انبعاث الأشعة السينية) أجريت على العينة يوفر معلومات حول الكثافة الخلوية، توزيع محلية العناصر الكيميائية، فضلا عن محتوى جسيمات نانوية الهاتف الخلوي. وهناك حاجة متزايدة لهذه الأدوات التحليلية داخل الأحياء، ولا سيما في سياق الناشئة من نانوتوكسيكولوجي والتي يجب تعميق قدرتنا على الفهم للتفاعلات بين الجسيمات النانوية والعينات البيولوجية لطب النانوي. على وجه الخصوص، كما لا تتطلب تحليل ميكروبروبي النووية جسيمات نانوية أن يكون المسمى، وفرة نانوحبيبات قابلة للقياس وصولاً إلى مستوى الخلية الفردية في عدد سكان خلية، صرف النظر عن حالتها السطحية.
Introduction
يتحدد التوازن الخلوية بمراقبة الامتصاص والاستيعاب، والتعريب داخل الخلايا لمختلف العناصر النزرة (أيونات، المعادن، والمركبات غير العضوية الخارجية). كثيرا ما تكون في شكل آثار هذه المكونات، ولكن مع ذلك قد يكون لها أثر كبير في الفسيولوجيا النظام. وهكذا، دراسة الكيمياء الحيوية في الخلية في الحالات العادية والمرضية/أكد مفتاح خطوة نحو فهم الآليات الأيضية الخلوية شاملة. ولذلك، يصبح من الضروري تطوير تقنيات التصوير والتحليل تمكن التحقيق من وفرة المواد الكيميائية داخل الخلايا، والهيكل التنظيمي ووظائفها الاستقلابية ذات الصلة. أساليب قليلة جداً قادرون على تقديم في الوضع الطبيعي كمية قطعة من المعلومات بشأن طبيعة المواد الكيميائية عموما لنموذج معين. وبصرف النظر عن أساليب تحليل العينات في شكل مجمع، النظر في الموقع تحليلات العينات البيولوجية في هذه التكاملية دون فقدان المعلومات الشامل والهيكلي، وبالتالي الحفاظ على هذه المواد الكيميائية المكونة لها (العناصر النزرة والايونات) و البروتينات. وعلاوة على ذلك، كما نانوسسينسيس مواصلة تطوير، تصوير محسنة والأساليب التحليلية للرصد البيئي على المستوى الخلوي ستكون اللازمة لمراقبة وقياس نانو-كائن السلوكيات والتفاعلات. 1
وقد حددت جسيمات نانوية (NPs) ككائنات العارضة البعد الوجه واحد على الأقل في مجموعة 1 و 100 نانومتر. 2 نظراً لخصائصها الفيزيائية خاصة، مصادر القدرة النووية تستخدم على نطاق واسع في الصناعة. وتستخدم مصادر القدرة النووية في التطبيقات الحيوية وفي لطب النانوي. 3 , 4 الخصائص الفيزيائية العديد من مصادر القدرة النووية، وعلى الرغم من أنها قد تولد بعض المخاطر من آثار ضارة على صحة الإنسان والبيئة. يمكن أن هذه المخاطر الناجمة عن التعرض لفترات طويلة ومتكررة على حد سواء التركيز على مختلف المستويات، وهذا قد لا بعد بوضوح. 5 , 6 , 7 , 8 على وجه الخصوص، مصير مصادر القدرة النووية داخل الخلايا والاستجابات الخلوية المرتبطة بها، حتى الآن، وصف غير كامل. وهذا جزئيا بسبب ندرة الأساليب التي تسمح الكشف والتحديد الكمي لمصادر القدرة النووية المدخلة في خلية واحدة. 9
إلى جانب الأدوات التحليلية الكلاسيكية المستخدمة لتقدير الجرعة الخلوية من جسيمات نانوية ميكروسكوبيس، الطيف الكتلي (مللي ثانية)، الحث البلازما مرض التصلب العصبي المتعدد (برنامج المقارنات الدولية-MS)10،11 واللوني السائل مرض التصلب العصبي المتعدد (LC-مرض التصلب العصبي المتعدد)، ولكنها لا توفر سوى الحصول على معلومات مفيدة في نطاق العيانية. أيا منها لا يمكن أن توفر إجراء تقييم دقيق لمحتوى NPs سوبسيلولار ولا توزيع مصادر الطاقة النووية دون الاستخدام أساليب تجزئة. تقييم منهجي للاستجابة للجرعة وبالتالي مستحيل مع هذه الأساليب، بدلاً من الأساليب استناداً إلى التحليل الطيفي الذري مثل ميكروبروبي النووية تحليل12،13، السنكروتروني الأشعة الفلورية مجهرية14 ، والثانوية أيون الطيف الكتلي (سيمز). 15 , 16 هذه الأساليب مثيرة للاهتمام خاصة كما أنها تكمل الملاحظات باستخدام مجهر الأسفار، ولا سيما عند مصادر القدرة النووية لا يمكن أن يكون المسمى مع جزيئات الفلورسنت وهكذا تدرس في دولته الأصلية. إلى حد ما، حتى عندما يتم المطعمة NPs مع فلوروفوريس، (ط) القياس الكمي لا تزال صعبة لأن مستوى العلامات الواحدة التي أرستها غير معروف ويجوز تعديل (ثانيا) تعديل المواد الكيميائية السطحية التي أرستها توزيعه الخلوية.
في هذه المقالة، نركز على أسلوب يقوم على مزيج من التقنيات النووية ميكروبروبي تهدف إلى تصوير مورفولوجيا وتكوين عنصري من العينات البيولوجية في الكبرى، ثانوية، وتتبع تركيزات.
تحليل ميكروبروبي النووية يثبت أن تكون ملائمة بصفة خاصة لقياس العناصر الكيميائية النزرة في الأنسجة البيولوجية. شعاع القرار الأفقي (0.3 إلى 1 ميكرومتر) وحساسية في الكشف عن العناصر الكيميائية (من 1 إلى 10 µg.g-1 وزن جاف) هي أيضا مناسبة للدراسات على المستوى الخلوي. وتستند التقنيات النووية ميكروبروبي كشف الجسيمات (الفوتونات والإلكترونات والايونات) ينبعث بعد شعاع أيون (عادة قيد التشغيل في الطاقات مليون إلكترون فولط) تتفاعل مع الذرات الموجودة في العينة. التفاعلات التي تحدث في الخلايا بشكل رئيسي: 1) الإثارة/تاين الذرات متبوعاً انبعاث الفوتونات بعد الذرات العودة إلى حالتها الأساسية؛ و 2) نشر جزيئات واردة مما يؤدي إلى تغيير في الطاقة والاتجاه. القياس لتحديد اللووسثي الطاقة الجسيمات المنبعثة من ذرات تشارك في التفاعل. للقيام بتعيين العناصر، microbeam أيون هو مرارا وتكرارا الممسوحة ضوئياً على سطح العينة، كثيرا ما على مساحة حوالي 100 من 100 ميكرومتر2 التي تحتوي على عدة خلايا. يتم الكشف عن الجسيمات المنبعثة واحتياجاتها من الطاقة يتم تسجيلها لكل موقف الحزم. الفرز من الجسيمات وفقا لموقف الحزم، وبالتالي تحديد هيكل المسؤولة عن انبعاث هذه الجزيئات هو هدف معالجة البيانات. هنا، نحن دقة وصف نهج قائم على الأسفار مجهرية وتحليل ميكروبروبي النووي للكشف عن، وكذلك قياس مصادر خارجية في جداول الخلوية والخلوية الفرعية، بغية التحقيق في آثار التفاعلات التي أرستها بالمعيشة نظم. ونحن خاصة تركز على الفرص التي يتيحها هذا الأسلوب من حيث الكمي في الموقع لثاني أكسيد التيتانيوم جسيمات نانوية (TiO2 NPs) المجاميع على مستوى سوبسيلولار.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف لنا طريقة توفير معلومات مفيدة تتجاوز ما هو ممكن مع تقنيات التصوير الأخرى، لا سيما على مستوى سوبسيلولار. بالإضافة إلى قدرتها التصوير، يقدم التحليل ميكروبروبي النووية أيضا إمكانيات للتحديد الكمي للعناصر الكيميائية التي تدخل في تكوين عينة بيولوجية. في هذا العمل، نحن درس السكان الخلايا …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر “تفاوضي سيرج” لتوجيه وتحرير الفيديو. وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية تؤيد برنامج البحوث تيتانيومس (ANR CES 2010، جوان CESA 009 01). يزار والجماعة الأوروبية كنشاط إدماج توفير “الدعم من الجمهور والصناعية البحث استخدام أيون شعاع التكنولوجيا (روح)” إطار المفوضية الأوروبية عقد ° ن 227012. هذا العمل أيدته “ماري كوري الإجراءات”-شبكات التدريب الأولية (ITN) “إدماج النشاط دعم الدراسات العليا مع التدريب الداخلي في الصناعة والتدريب التميز البحثي” (العفريت، D1.3) وبموجب العقد رقم 317169 من المفوضية الأوروبية. الغرب سود الكبير C’NANO واكيتين المنطقة دعم برنامج أبحاث إزالة-نانو (رقم 20111201003) وبرنامج البحوث بوبرا (جوان 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
Referências
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety – A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies – A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. . Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. . SIMNRA User’s Guide, Report IPP 9/113. , (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
