सीटू में परमाणु Microprobe विश्लेषण का उपयोग करके मेटल ऑक्साइड नैनोकणों का पता लगाना और एकल सेल ठहराव
Summary
हम मानव कोशिकाओं में सीटू में मौजूद रासायनिक तत्वों का पता लगाने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन और साथ ही उनके इन विट्रो ठहराव. विधि किसी भी सेल प्रकार के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है और विशेष रूप से एक कोशिकाओं में मात्रात्मक रासायनिक विश्लेषण के लिए उपयोगी है इन विट्रो धातु ऑक्साइड नैनोकणों जोखिम में निंनलिखित ।
Abstract
रासायनिक तत्व इमेजिंग पर आधारित सूक्ष्म विश्लेषणात्मक तकनीक स्थानीयकरण और सेलुलर स्तर पर रासायनिक संरचना के ठहराव सक्षम करें । वे प्रणालियों के लक्षण वर्णन के लिए नई संभावनाएं प्रदान करते है और पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं, स्थानीयकरण और धातु ऑक्साइड नैनोकणों की उपस्थिति दोनों जैविक नमूनों और वातावरण में बढ़ाता है । दरअसल, इन तकनीकों सभी (i) संवेदनशीलता के संदर्भ में प्रासंगिक आवश्यकताओं को पूरा (से 1 तक 10 µ जी के शुष्क जन के जी-1 ), (ii) माइक्रोमीटर रेंज स्थानिक संकल्प, और (iii) बहु तत्व का पता लगाने । इन विशेषताओं को देखते हुए, microbeam रासायनिक तत्व इमेजिंग शक्तिशाली ऐसे ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में नियमित इमेजिंग तकनीकों पूरक कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे करने के लिए एक परमाणु microprobe विश्लेषण पर कल्चरल सेल (U2OS) को उजागर टाइटेनियम डाइऑक्साइड नैनोकणों । कोशिकाओं पर बढ़ने और एक विशेष रूप से डिजाइन नमूना ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर और परमाणु microprobe विश्लेषण चरणों में इस्तेमाल किया धारक में सीधे उजागर किया जाना चाहिए । डुबकी फ्रीज नमूने के क्रायोजेनिक निर्धारण सेलुलर संगठन और रासायनिक तत्व वितरण दोनों को बरकरार रखता है । एक साथ परमाणु microprobe विश्लेषण (स्कैनिंग ट्रांसमिशन आयन माइक्रोस्कोपी, रदरफोर्ड backscattering स्पेक्ट्रोमेट्री और कण प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन) नमूना पर प्रदर्शन सेलुलर घनत्व के बारे में जानकारी प्रदान करता है, के स्थानीय वितरण रासायनिक तत्व, साथ ही नैनोकणों के सेलुलर सामग्री । वहां जीव विज्ञान के भीतर इस तरह के विश्लेषणात्मक उपकरणों के लिए एक बढ़ती जरूरत है, विशेष रूप से Nanotoxicology और Nanomedicine के उभरते संदर्भ में जिसके लिए नैनोकणों और जैविक नमूनों के बीच बातचीत की हमारी समझ गहरा होना चाहिए । विशेष रूप से, के रूप में परमाणु microprobe विश्लेषण नैनोकणों लेबल की आवश्यकता नहीं है, nanoparticle बहुतायत एक कोशिका की आबादी में व्यक्तिगत कोशिका स्तर पर नीचे quantifiable हैं, स्वतंत्र रूप से उनकी सतह राज्य के ।
Introduction
सेलुलर homeostasis नियंत्रण, आत्मसात, और विभिन्न ट्रेस तत्वों (आयनों, धातुओं, exogenous अकार्बनिक यौगिकों) के intracellular स्थानीयकरण द्वारा निर्धारित किया जाता है । इन घटकों अक्सर अंश के रूप में हैं, लेकिन फिर भी सिस्टम फिजियोलॉजी में काफी प्रभाव पड़ सकता है । इस प्रकार, दोनों सामांय और रोग/पर जोर दिया स्थितियों में सेल जैव रसायन का अध्ययन सेलुलर चयापचय तंत्र की एक समग्र समझ की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है । इसलिए, इमेजिंग और विश्लेषणात्मक intracellular रासायनिक बहुतायत, संरचनात्मक संगठन और उनके संबंधित चयापचय कार्यों की जांच को सक्षम करने की तकनीक के विकास के लिए आवश्यक हो जाता है । बहुत कुछ तरीके एक दिए गए नमूने के समग्र रासायनिक प्रकृति के विषय में जानकारी के एक सीटू में मात्रात्मक टुकड़ा प्रदान करने में सक्षम हैं । इसके अलावा थोक रूप में नमूनों का विश्लेषण तरीकों से, सीटू विश्लेषण में बड़े पैमाने पर और संरचनात्मक जानकारी खोने के बिना अपने अभिंनता में जैविक नमूनों पर विचार, जिससे उनके घटक रसायनों के संरक्षण (तत्वों और आयनों का पता लगाने) और प्रोटीन. इसके अलावा, nanosciences के रूप में विकसित करने के लिए जारी रखने के लिए, बेहतर इमेजिंग और विश्लेषणात्मक तरीके सेलुलर पैमाने पर पर्यावरण की निगरानी के लिए निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हो जाएगा और नैनो वस्तु व्यवहार और बातचीत को बढ़ाता है । 1
नैनोकणों (एनपीएस) को 1 और १०० एनएम रेंज में कम एक चेहरे आयाम प्रदर्शित वस्तुओं के रूप में परिभाषित किया गया है । 2 उनके विशेष भौतिक गुणों के कारण एनपीएस का बड़े पैमाने पर उद्योग में उपयोग किया जाता है । एनपीएस बायो-एप्लीकेशन में और nanomedicine में कार्यरत हैं । 3 , 4 एनपीएस की अनेक भौतिक विशेषताओं के बावजूद, वे मानव स्वास्थ्य और पर्यावरण पर प्रतिकूल प्रभाव के कुछ जोखिम उत्पन्न कर सकते हैं । इन खतरों विभिंन एकाग्रता के स्तर पर दोनों लंबे समय तक और दोहराए जोखिम से प्रेरित किया जा सकता है और यह अभी तक स्पष्ट रूप से स्थापित नहीं किया गया है । 5 , ६ , 7 , 8 विशेष रूप से, कोशिकाओं और संबद्ध सेलुलर प्रतिक्रियाओं के अंदर एनपीएस के भाग्य, तारीख को पूरी तरह से वर्णित नहीं हैं । यह एक सेल में आंतरिक एनपीएस का पता लगाने और ठहराव की अनुमति देने वाले तरीकों की किल्लत के कारण हिस्से में है । 9
शास्त्रीय विश्लेषणात्मक उपकरण नैनोकणों की सेलुलर खुराक का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया सूक्ष्मदर्शी हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), inductively युग्मित प्लाज्मा एमएस (आईसीपी-ms)10,11 और तरल क्रोमैटोग्राफी एमएस (LC-ms), लेकिन वे केवल प्रदान macroscopic पैमाने पर उपयोगी जानकारी । इनमें से कोई भी उपसेलुलर एनपीएस सामग्री का सटीक मूल्यांकन नहीं दे सकता और न ही एनपीएस के उपयोग के बिना वितरण की विधियां । खुराक का एक व्यवस्थित मूल्यांकन-प्रतिक्रिया इस प्रकार असंभव है इन तरीकों के साथ, के रूप में परमाणु स्पेक्ट्रोस्कोपी पर आधारित तरीकों का विरोध किया जैसे नाभिकीय microprobe विश्लेषण12,13, सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी14 , और द्वितीयक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सिम्स) । 15 , 16 इन तरीकों विशेष रूप से दिलचस्प है के रूप में वे टिप्पणियों पूरक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर बनाया है, खासकर जब एनपीएस फ्लोरोसेंट अणुओं के साथ लेबल नहीं किया जा सकता है और इस तरह अपने पैतृक राज्य में अध्ययन कर रहे हैं । कुछ हद तक, जब भी एनपीएस fluorophores के साथ भ्रष्टाचार कर रहे हैं, (i) ठहराव मुश्किल रहता है क्योंकि प्रति np टैगिंग स्तर अज्ञात है और (ii) एनपी की सतह के रासायनिक संशोधन अपने सेलुलर वितरण को संशोधित कर सकते हैं ।
इस अनुच्छेद में, हम इमेजिंग पर लक्ष्य परमाणु microprobe तकनीकों का एक संयोजन के आधार पर एक विधि पर ध्यान केंद्रित आकृति विज्ञान और प्रमुख, माइनर में जैविक नमूनों की मौलिक रचना, और ट्रेस सांद्रता ।
नाभिकीय microprobe विश्लेषण जैविक ऊतकों में रासायनिक तत्वों का पता लगाने की माप के लिए विशेष रूप से उपयुक्त साबित होता है । दोनों बीम पार्श्व संकल्प (०.३ 1 µm) और रासायनिक तत्व का पता लगाने में संवेदनशीलता (1 से 10 µ g. g-1 शुष्क मास) सेलुलर स्तर पर अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं । परमाणु microprobe तकनीक कणों का पता लगाने (फोटॉनों, इलेक्ट्रॉनों, आयनों) आयन बीम के बाद उत्सर्जित (आमतौर पर MeV ऊर्जा पर चलने) नमूने में मौजूद परमाणुओं के साथ बातचीत के आधार पर कर रहे हैं । कोशिकाओं में होने वाले इंटरैक्शन मुख्य रूप से हैं: 1) उत्तेजना/ionization परमाणुओं के बाद फोटॉनों के एक उत्सर्जन के बाद उनके मौलिक राज्य में लौटने; और 2) आने वाले कणों के प्रसार के लिए अपनी ऊर्जा और दिशा में परिवर्तन अग्रणी । उत्सर्जित कण ऊर्जा की माप allowsthe बातचीत में शामिल परमाणुओं की पहचान । तत्वों की मैपिंग प्रदर्शन करने के लिए, आयन microbeam बार नमूना सतह पर अक्सर स्कैन कर रहा है, के बारे में १०० के एक क्षेत्र से अधिक बार १०० µm2 कई कोशिकाओं से युक्त. उत्सर्जित कणों का पता लगाया है और उनकी ऊर्जा प्रत्येक बीम स्थिति के लिए दर्ज की गई है । बीम स्थिति के अनुसार कणों की छंटाई, इस प्रकार के कणों के उत्सर्जन के लिए जिंमेदार संरचना की पहचान डेटा उपचार का उद्देश्य है । यहां, हम ठीक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और परमाणु microprobe विश्लेषण पर आधारित का पता लगाने के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेलुलर और उप सेलुलर तराजू पर exogenous एनपीएस की जांच करने के लिए, के क्रम में रहने के साथ एनपी बातचीत के परिणामों की जाँच करने के लिए का वर्णन सिस्टम. हम विशेष रूप से सीटू ठहराव के टाइटेनियम डाइऑक्साइड नैनोकणों (TiO2 एनपीए) में उपसेलुलर स्तर पर समुच्चय के संदर्भ में इस पद्धति द्वारा पेश अवसरों पर ध्यान केंद्रित करेगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम विशेष रूप से उपसेलुलर स्तर पर, अंय इमेजिंग तकनीकों के साथ क्या संभव है परे उपयोगी जानकारी उपलब्ध कराने के एक विधि का वर्णन । इसके इमेजिंग क्षमता के अलावा, नाभिकीय microprobe विश्लेषण भी रासायनिक तत्वों के ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम निर्देशन और वीडियो के संपादन के लिए Serge सीमा का शुक्र है । फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी अनुसंधान कार्यक्रम टाइटेनियम का समर्थन करता है (ANR CES २०१०, एन ° CESA ००९ ०१) । CNRS और यूरोपीय समुदाय के एक एकीकृत गतिविधि के रूप में सार्वजनिक और औद्योगिक आयन बीम प्रौद्योगिकी (आत्मा) का उपयोग कर अनुसंधान के समर्थन “चुनाव आयोग अनुबंध n ° २२७०१२ के तहत प्रदान की । यह काम मैरी क्यूरी क्रियाएं द्वारा समर्थित किया गया है-प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क (ITN) के रूप में एक “एकीकृत गतिविधि उद्योग और प्रशिक्षण उत्कृष्टता में इंटर्नशिप के साथ स्नातकोत्तर अनुसंधान का समर्थन” (प्रेत, डी 1.3) ईसी अनुबंध no. ३१७१६९ के तहत । C’NANO ग्रांड सूद Ouest और क्षेत्र Aquitaine अनुसंधान कार्यक्रम TOX-नैनो (n ° 20111201003) और अनुसंधान कार्यक्रम POPRA (n ° 14006636-034) का समर्थन है ।
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
Referências
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