In Situ Gjenkjennings- og enkeltcelle kvantifisering av metalloksid nanopartikler kjernefysiske Microprobe analyse
Summary
Vi beskriver en prosedyre for påvisning av kjemiske elementer stede i situ i menneskeceller samt kvantifisering i vitro . Metoden er velegnet for en celle type og er spesielt nyttig for kvantitative kjemiske analyser i enkeltceller etter i vitro metalloksid nanopartikler eksponering.
Abstract
Mikro-analytiske teknikker basert på grunnstoff imaging Aktiver lokalisering og kvantifisering av kjemiske sammensetning på cellenivå. De tilbyr nye muligheter for karakterisering av levende systemer og er spesielt passende for å oppdage, lokalisere og kvantifisere tilstedeværelsen av metalloksid nanopartikler både i biologiske prøver og miljø. Faktisk oppfyller disse teknikkene alle relevante krav i form av (i) følsomhet (fra 1 til 10 µg.g-1 på tørr masse), (ii) mikrometer utvalg romlig oppløsning og (iii) flere elementer gjenkjenning. Gitt disse egenskapene, microbeam grunnstoff bildebehandling kan kraftfullt utfylle rutinemessig Bildeteknikker som optisk og fluorescens mikroskopi. Denne protokollen beskriver hvordan du utfører en kjernefysisk microprobe analyse på kulturperler celler (U2OS) utsatt for titandioksid nanopartikler. Cellene må vokse og utsettes direkte i en spesialdesignet eksempel holder brukes på optisk mikroskopet og de kjernefysiske microprobe analyse stadiene. Spranget frostvæske kryogene fiksering av prøvene beholder både mobilnettet organisasjonen og grunnstoff distribusjon. Samtidige kjernefysiske microprobe analyse (skanning overføring ion mikroskopi, Rutherford backscattering massespektrometri og partikkel indusert X-ray utslipp) utføres på prøven gir informasjon om mobilnettet tetthet, lokal distribusjon av grunnstoffene, i tillegg til mobilnettet innholdet i nanopartikler. Det er et økende behov for slike analyseverktøy biologi, spesielt i fremvoksende sammenheng med Nanotoxicology og Nanomedicine som vår forståelse av samspillet mellom nanopartikler og biologiske prøver må utdypes. Spesielt som kjernefysisk microprobe analyse ikke krever nanopartikler skal merkes, er hydrogenion krillens kvantifiserbare ned til enkeltcelle nivå i en celle befolkningen, uavhengig av deres overflate tilstand.
Introduction
Mobilnettet homeostase bestemmes av opptak kontroll, assimilering og intracellulær lokalisering av ulike sporstoffer (ioner, metaller, eksogene uorganiske forbindelser). Disse komponentene er ofte i form av spor, men likevel kan ha en betydelig innvirkning på systemet fysiologi. Dermed er studiet av cellen biokjemi både normal og patologisk/stresset situasjoner en nøkkel-skritt mot en helhetlig forståelse av mobilnettet metabolske mekanismer. Derfor blir utviklingen av tenkelig og analytiske teknikker slik at etterforskningen av intracellulær kjemiske krillens, strukturelle organisasjon og sine metabolske funksjoner nødvendig. Svært få metoder er kjøpedyktig skaffe en i situ kvantitative opplysning om generell kjemisk natur et gitt utvalg. Bortsett fra metoder analysere prøver i skjemaet bulk, i situ analyser vurdere biologiske prøver i deres integrality uten å miste og strukturelle informasjon, dermed bevare deres konstituerende kjemikalier (sporstoffer og ioner) og proteiner. Videre, som nanosciences fortsetter å utvikle, forbedret bildebehandling og analytiske metoder for miljøovervåking i mobilnettet skala vil være nødvendig å observere og kvantifisere nano-objekt atferd og interaksjoner. 1
Nanopartikler (NPs) er definert som objekter viser minst én ansikts dimensjon i område 1 og 100 nm. 2 på grunn av bestemt mekanisk-egenskaper, NPs er mye brukt i industrien. NPs er ansatt i bio-programmer og nanomedicine. 3 , 4 til tross for mange mekanisk-egenskapene til NPs, kan de genererer noen risiko for uønskede effekter på helse og miljø. Disse risikoene kan indusert ved både langvarig og repeterende eksponeringer på ulike konsentrasjon nivåer og dette har ennå ikke blitt klart etablert. 5 , 6 , 7 , 8 spesielt skjebnen til NPs inne celler og tilknyttede mobilnettet svarene er hittil ikke fullstendig beskrevet. Dette er delvis på grunn av knapphet på metoder som gjør oppdagelsen og kvantifisering av internalisert NPs i en enkelt celle. 9
De klassiske analyseverktøy som brukes til å beregne mobilnettet dosen av nanopartikler er microscopies, massespektrometri (MS), kombinert Induktivt plasma MS (ICP-MS)10,11 og flytende kromatografi MS (LC-MS), men de bare gir nyttig informasjon på makroskopisk skala. Ingen av dem kan gi en nøyaktig vurdering av subcellular NPs innholdet eller NPs distribusjon uten bruk av fraksjoneres metoder. En systematisk vurdering av dose-respons er derfor umulig med disse metodene, i motsetning til metoder basert på Atom spektroskopi som kjernefysisk microprobe analyse12,13, synchrotron X-ray fluorescens mikroskopi14 , og sekundære Ion massespektrometri (SIMS). 15 , 16 disse metodene er spesielt interessant som de utfyller observasjoner med fluorescens mikroskopi, spesielt når NPs ikke merkes med fluorescerende molekyler og er dermed studerte i sin opprinnelige tilstand. I noen grad, selv når NPs er podet med fluorophores, fortsatt (i) kvantifisering vanskelig fordi merking per NP er ukjent og (ii) kjemisk endring av NP overflaten kan endre mobilnettet distribusjon.
I denne artikkelen vi fokusere på en metode basert på en kombinasjon av kjernefysiske microprobe teknikker sikte på imaging morfologi og elementær sammensetning av biologiske prøver i store, små, og spore konsentrasjoner.
Kjernefysiske microprobe analyse viser seg for å være spesielt egnet for måling av kjemiske sporstoffer i biologisk vev. Både strålen lateral oppløsning (0,3 til 1 µm) og følsomhet i grunnstoff gjenkjenning (fra 1 til 10 µg.g-1 tørr masse) er godt egnet for studier på cellenivå. Kjernefysiske microprobe teknikker er basert på partikler gjenkjenning (fotoner, elektroner, ioner) slippes ut etter ion strålen (vanligvis kjører på MeV energier) samhandler med atomer i utvalget. Samhandlinger som oppstår i cellene er hovedsakelig: 1) eksitasjon/ionisering atomer etterfulgt av et utslipp av fotoner etter atomer tilbake til grunnleggende tilstand; og 2) spredning av innkommende partikler fører til endring i sin energi og retning. Måling av slippes ut partikkel energi allowsthe identifikasjon av atomer som er involvert i interaksjonen. For å utføre kartlegging av elementer, skannes ion microbeam gjentatte ganger over eksempel overflaten, ofte over et område på ca 100 av 100 µm2 som inneholder flere celler. Slippes ut partikler oppdages og energi er registrert for hver bjelke posisjon. Sortering av partikler i henhold til strålen posisjon, er således identifiserte strukturen ansvarlig for utslipp av slike partikler målet med behandling av personopplysninger. Her beskriver vi nettopp tilnærming basert på fluorescens mikroskopi og kjernefysiske microprobe analyse å merker samt å kvantifisere eksogene NPs på mobilnettet og sub mobilnettet skalaer, for å undersøke konsekvensene av NP interaksjon med levende systemer. Vi skal spesielt fokusere på mulighetene som tilbys av denne metoden i i situ kvantifisering av titandioksid nanopartikler (TiO2 NPs) aggregater på subcellular nivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en metode for å gi nyttig informasjon utover det som er mulig med andre Bildeteknikker, særlig på subcellular nivå. I tillegg til sin bildebehandling evne tilbyr kjernefysiske microprobe analyse også muligheter for kvantifisering av kjemiske elementer inn i sammensetningen av en biologisk prøve. Den nåværende arbeidet, vi studerte menneskelige celle populasjoner og fokusert til analyse av en valgt region på rente basert på en enkelt celle utsatt for TiO2 NPs. Kombinasjonen med andre tekn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Serge Borderes for regi og redigering av video. Fransk National Research Agency støtter forskningsprogrammet TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). CNRS og EU som en integrering aktivitet gitt “støtte av offentlig og industriell forskning bruker Ion strålen teknologi (SPIRIT)” under EU kontrakt n ° 227012. Dette arbeidet har blitt støttet av Marie Curie handlinger – første trening nettverk (ITN) som en “integrere aktivitet støtte Postgraduate forskning med praksisplasser i industrien og trening Excellence” (SPRITE, D1.3) under EF kontrakt nr. 317169. C’NANO Grand Sud Ouest og regionen Aquitaine støtte forskningsprogrammet TOX-NANO (n ° 20111201003) og forskningsprogrammet POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
Referências
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety – A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies – A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. . Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. . SIMNRA User’s Guide, Report IPP 9/113. , (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
