Este protocolo describe un método robusto, reproducible y simple de aislamiento y cultivo de células de mioblastos progenitoras del músculo esquelético de adultos y personas de edad avanzada. Los músculos que se usan aquí incluyen los músculos del pie y de la pierna. Este enfoque permite el aislamiento de una población enriquecida de mioblastos primarios para los estudios funcionales.
homeostasis del músculo esquelético depende del crecimiento muscular (hipertrofia), la atrofia y la regeneración. Durante el envejecimiento y en varias enfermedades, se produce pérdida de masa muscular. La pérdida de masa muscular y la función está asociada con el tipo de fibra muscular atrofia, el tipo de fibra de conmutación, la regeneración del músculo defectuoso asociado con la disfunción de las células satélite, células madre de músculo, y otros procesos patofisiológicos. Estos cambios están asociados con los cambios en intracelular, así como nichos locales y sistémicos. Además de los modelos de roedores más comunes de envejecimiento muscular, existe la necesidad de estudiar la homeostasis y desgaste del músculo utilizando modelos humanos, los cuales, debido a las implicaciones éticas, consisten principalmente en cultivos in vitro. A pesar del amplio uso de células progenitoras humanas miogénica (PSM) y mioblastos primarios en la miogénesis, hay datos limitados sobre el uso de cultivos de mioblastos y miotubos primarios humanos para estudiar los mecanismos moleculares que regulan diferentes aspectos de mus asociada a la edademaciación CLE, ayudando en la validación de los mecanismos del envejecimiento propuesto en el músculo de roedores. El uso de PSM humanos, mioblastos primarios y miotubos aisladas de adultos y mayores de personas, proporciona un modelo fisiológicamente relevantes de los mecanismos moleculares de los procesos asociados con el crecimiento muscular, atrofia y la regeneración. A continuación se describe en detalle un protocolo robusta, de bajo costo, reproducible y eficiente para el aislamiento y mantenimiento de PSM humanos y su progenie – mioblastos y miotubos a partir de muestras de músculo humano utilizando digestión enzimática. Por otra parte, se ha determinado el número de pases en el que los mioblastos primarios de adultos y personas de edad se someten a la senescencia en un cultivo in vitro. Finalmente, se muestra la capacidad de transfectar estas mioblastos y la capacidad de caracterizar su capacidad de proliferación y diferenciación y proponer su idoneidad para la realización de estudios funcionales de los mecanismos moleculares de la miogénesis y desgaste muscular in vitro. </p>
la pérdida de las enfermedades ya relacionada con la edad progresiva de la masa y de la función músculo esquelético resulta en la fragilidad, la disminución de la fuerza y la disminución de la calidad de vida de las personas de edad avanzada. Representa el músculo esquelético de masa corporal aproximadamente el 40% 1. Durante el envejecimiento y la enfermedad, la atrofia progresiva de miofibras individuales y reducción de la calidad del músculo debido a la infiltración de la grasa y la fibrosis se produce 1, 2, 3, 4, 5, 6. Recientemente, se ha propuesto que las diferencias específicas de las especies en el envejecimiento del músculo esquelético se producen, en concreto que la pérdida de fibra muscular se produce en roedores, no se puede producir en los seres humanos 7. Sin embargo, las fibras musculares restantes de los mamíferos de edad se caracterizan por una mayor susceptibilidad a daños y deterioro de regeneración <supclass = "xref"> 8. La reparación del músculo adulto y mantenimiento está mediada por células satélite 9, 10. Tras la lesión muscular y otras señales pertinentes, las células satélite se activan y proliferan. Un subconjunto de las células vuelve al estado de reposo y el resto progresa en mioblastos (células progenitoras miogénica – PSM). Esto contribuye a la reparación de la miofibrilar existente 11. La funcionalidad de las células satélite determina el éxito de la regeneración muscular y los cambios en la disponibilidad de células satélite con el envejecimiento ha sido demostrada 12, 13, 14, 15. Por otra parte, las células satélite de músculo de los seres humanos de edad y roedores muestran un interruptor de perfil transcripcional y la reducción de potencial de regeneración 16, 17, </sup> 18, 19. Las células satélite de músculo de ratones viejos y los seres humanos también se ha demostrado que someterse a la senescencia que resulta en su funcionalidad reducida 20.
La línea celular más establecida que permite el estudio de la homeostasis del músculo es la línea celular murina C2C12 21. Una cantidad significativa de estudios también han utilizado mioblastos primarios murinos 22. Estos cultivos han llevado a una comprensión significativa de los procesos que ocurren durante la hipertrofia enfermedad muscular y envejecimiento 23, 24, 25, 26 murina y la miogénesis vertebrados así como la regeneración muscular, atrofia myotube / miofibras, y. Más recientemente, varios grupos han descrito el uso de mioblastos primarios humanos para estudiar la miogénesis y el envejecimiento muscular. Sin embargo, hay una falta de consenso con regards a diferencias entre los mioblastos primarios aislados del músculo de los seres humanos adultos y mayores de 27, 28, 29, 30, 31. A pesar de las diferencias que se caracterizan en el entorno local y sistémica que ocurren durante el desarrollo, el envejecimiento y la enfermedad de 6, 32, 33, 34, in vitro mioblastos y miotubos culturas siguen siendo las herramientas más accesibles para el estudio de los mecanismos moleculares asociados con el desarrollo muscular, el crecimiento y la atrofia. Además, estos estudios proporcionan no sólo un sólido, pero también una relativamente rápida, de bajo costo y de alto rendimiento pt herramienta vitro. Por otra parte, las implicaciones éticas asociadas con los estudios de los músculos humanos significan que para los experimentos funcionales que implican la manipulación de la expresión génica <em>, In vitro mioblastos y miotubos culturas humanas siguen siendo la única alternativa disponible para los organismos modelo de vertebrados.
Aquí, se muestra un protocolo experimental simple para robusta, de bajo costo, y reproducible aislamiento de mioblastos primarios, o PSM, desde el músculo de adultos y personas de edad avanzada y describir las condiciones normalizadas de cultivo in vitro (Figura 1). Como cultivos primarios de fibroblastos muscular suelen contener, además de los mioblastos, se recomienda un paso preplating el objetivo de mejorar la pureza y la calidad de los mioblastos primarios. En resumen, hemos establecido un protocolo que permite el aislamiento eficiente y reproducible, la cultura y los estudios funcionales de PSM / mioblastos primarios enriquecidos y funcionales de músculo esquelético de los adultos y las personas de edad avanzada.
A continuación, presentamos un método simple, robusta, de bajo costo, eficiente y reproducible de aislar células progenitoras de músculo / mioblastos primarios de los adultos y los ancianos a los humanos de extensor corto digitorium, tibial anterior o halluces abductores músculos. Este protocolo tiene como objetivo permitir que los estudios que utilizan mioblastos primarios humanos de adultos y mayores de seres humanos, especialmente cuando los métodos más sofisticados, tales como FACS- o MACS-clasificación, no son posibles o no es práctico.
El método de aislamiento presentado en este manuscrito dura aproximadamente 2 horas. Durante el aislamiento muscular, el músculo se lavó en etanol al 70% con el fin de evitar la contaminación. Antes de la disociación enzimática del músculo, es importante para cortar el músculo en pedazos pequeños pero visibles, y evitar daños en las células del exceso de picar carne. Los resultados de digestión en la disociación de miofibras y la liberación de las células satélite y células precursoras miogénicas. En nuestro caso de ~ 20 mg de músculo esquelético, uno de 60 mm(20 cm 2) placa de Petri fue el área de la superficie más adecuada para recoger las células. Células cultivadas en placas sobre una superficie más grande mostraron reducción de la proliferación, mientras que las células en placas sobre una superficie más pequeña mostró un aumento de la muerte celular y la aglutinación.
Tras el aislamiento, las células se cultivaron y se expandieron en placas de laminina-cubierta. El uso de superficies no revestidas tendió a disminuir el éxito del aislamiento. Por esta razón, las células se pueden cosechar preferiblemente sobre una superficie pre-recubierto directamente después del aislamiento. culturas fibroblastos enriquecidos predominarán en lugar de células mioblastos derivados de si las células se recogen en una superficie no revestida directamente después del aislamiento. Además de la laminina, el uso de otras soluciones de fijación celular, como Matrigel y reactivos a base de colágeno se puede utilizar. soluciones de recubrimiento pueden incluir factores de crecimiento y otros compuestos que promuevan el crecimiento celular, pero estos podrían alterar el comportamiento de las células y por lo tanto los resultados experimentales. Ennuestra experiencia, 10 mg / ml de laminina es la concentración óptima y el reactivo de revestimiento apropiado para las células satélite y de fijación de mioblastos y la proliferación ya que carece de cualquier factor de crecimiento u otros complementos. Por otra parte, la laminina está naturalmente presente en la lámina basal, directamente relacionado con el sarcolema, que desempeña una función clave en la unión de las células satélite y la migración a través de la fibra del músculo esquelético.
Los suplementos de los medios de cultivo también pueden tener una influencia perjudicial sobre el comportamiento de la mioblastos primaria. Para los grupos de factor de ejemplo crecimiento, tales como FGFs o IGFs, tienen efectos pleiotrópicos en cultivos de mioblastos primarios, con FGF-2 controlando tanto mitogénica y programado respuesta muerte celular 31. Por tanto, es necesario controlar rigurosamente las condiciones de cultivo, especialmente por las diferencias en el comportamiento de los mioblastos primarios aislados a partir de músculo de adultos y mayores de las personas son muy probable que sea debido a la pureza of las culturas y la probabilidad de fibroblastos que invaden los mioblastos en cultivo durante cultivos a largo plazo 35. Hemos utilizado 1-hora pre-chapado de las células durante la primera división en una superficie no recubierta con el fin de disminuir la contaminación de los cultivos con fibroblastos.
El método se describe es adecuado para el aislamiento de células progenitoras myogenic de los músculos de los seres humanos adultos y ancianos. La célula aislada consta de una población myogenic representante de células como se indica por un alto porcentaje de células miogénicas (expresión MyoD y propiedades miogénicas visualizadas por inmunotinción MF20 en las figuras 1 y 2) y se puede utilizar como un modelo in vitro para los estudios funcionales de los procesos asociado con la homeostasis del músculo.
Estudios previos han caracterizado el aislamiento y diferencias en las propiedades, o la falta de ella, de mioblastos humanos primarios a partir deadultos y personas mayores de 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 6 3, 37, 38. La existencia de geriátrica y / o no funcional PSM humano se ha demostrado 6, 20, 22. Sin embargo, no hay diferencia en el comportamiento de PSM humanos recién aislados también se ha demostrado 27. El protocolo permite el aislamiento de mioblastos primarios que retienen al menos parcialmente su fenotipo, como la reducción senescencia potencial o de proliferación de mioblastos primarios aislados a partir de músculo de las personas de edad y permite el uso de estoscélulas para estudios funcionales de los mecanismos moleculares de la homeostasis del músculo durante el envejecimiento 22.
Los mioblastos primarios aislados usando el método descrito aquí se pueden utilizar no sólo para los estudios de la diferenciación miogénica sino también a investigar los cambios intracelulares, tales como cambios en la expresión génica que se producen en las células precursoras miogénicas humanos durante el envejecimiento. Sin embargo, los cambios que se producen en las células durante la prolongada cultivo ex vivo deben tenerse en cuenta al analizar los cambios fenotípicos y genotípicos ocurren durante el envejecimiento. Recomendamos el uso de células recién aisladas para este fin.
Por otra parte, el método de cultivo de mioblastos primarios se describe aquí permite la expansión y relativamente cultivo a largo plazo de mioblastos humanos primarios, lo que permite robustos estudios funcionales in vitro. Hemos demostrado previamente que las células progenitoras myogenic aislados usando nuestro método se pueden utilizar tanto para el perfil de expresión y functional estudios de los procesos asociados con el envejecimiento muscular 22. Este método es aplicable también a los músculos de adultos y roedores viejos y permite el aislamiento de un cultivo enriquecido de mioblastos que se puede utilizar para el perfil de los cambios genéticos y epigenéticos durante el envejecimiento y estudios funcionales 22. Las limitaciones de este método incluyen el uso de, en algún grado, la población mixta de células en lugar de una población pura de células satélite, que se puede obtener usando métodos más sofisticados publicado el 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.
Se presenta un protocolo simplificado, asequible y reproducible para el aislamiento de células mioblastos primarios de los adultos y ancianoslos seres humanos. En nuestra experiencia, los métodos disponibles, más sofisticadas de aislamiento y cultivo de mioblastos humanos primarios (como MACS- o FACS-ordenados células satélite) son ideales para algunos tipos de estudios, como perfiles proteómicos o cambios de transcriptómica en las células. Sin embargo, estos métodos son caros, requieren por lo menos algún nivel de experiencia, y puede resultar difícil debido a la tasa proliferativa baja de las culturas y los fibroblastos overgrowing mioblastos mioblastos primarios puros.
Se presenta un protocolo reproducible, que permite que el simple aislamiento y cultivo de mioblastos humanos primarios para su uso en estudios funcionales. Además, se propone el uso de laminina 42 y el uso limitado de bFGF como factores clave para el éxito de una cultura 44. También proponemos evitar el estrés generado por centrifugación cuando se dividen las células y una etapa de pre-recubrimiento en el primer pasaje 45. En resumen, tenemosoptimizado un protocolo eficiente para el aislamiento y cultivo de mioblastos primarios / PSM de los músculos de los adultos y los seres humanos de edad que también es aplicable a los músculos de roedores y permite la expresión y estudios funcionales de la homeostasis del músculo.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC – Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.
60mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
Cell culture plates (6 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) . |
Cell culture plates (12 wells) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25cm2); 658175 (75cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml) | Cellstar Serological Pipettes. |
Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50. |
Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70µm polypropylene. |
Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; ctivity: >0.15 U/mg |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 units/mg solid. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL. |
DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red. |
DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67). |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence β-Galactosidase Staining). |
Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |