Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.
बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) छोटे endosomal व्युत्पन्न exosomes (Exos, व्यास <100 एनएम) और बड़े प्लाज्मा झिल्ली व्युत्पन्न microvesicles (MVS, व्यास> 100 एनएम) सहित की रिहाई के लिए एक मौलिक सेलुलर प्रक्रिया है कि सभी जीवित कोशिकाओं में होता है। ये पुटिकाओं परिवहन प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड मूल के उनके सेल के लिए और इन विट्रो अध्ययन में विशिष्ट कहनेवाला संचार के मध्यस्थों के रूप में उनके महत्व पर प्रकाश डाला है। ईवीएस सफलतापूर्वक विभिन्न शरीर के तरल पदार्थ से पृथक किया गया है और विशेष रूप से रक्त में ईवीएस कैंसर या संक्रामक रोगों के लिए बायोमार्कर का वादा के रूप में पहचान की गई है। आदेश में रक्त में एमवी उप-जनसंख्या के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए, हम परिधीय रक्त के नमूनों से मानकीकृत अलगाव और MVS के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। MVS अंतर centrifugation द्वारा EDTA-anticoagulated प्लाज्मा नमूनों से pelleted कर रहे हैं और आम तौर पर 100 की एक व्यास के अधिकारी – 600 एनएम। उनके बड़े आकार के कारण, वे कर सकते हैंआसानी से फ्लो, एक तकनीक है कि नियमित रूप से नैदानिक निदान में प्रयोग किया जाता है और सबसे प्रयोगशालाओं में उपलब्ध है द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। पृथक MVS की गुणवत्ता नियंत्रण assays के लिए कई उदाहरण दिया जाएगा और मार्करों है कि रक्त में विभिन्न एमवी उप-जनसंख्या के भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रस्तुत किया जाएगा।
पिछले वर्षों में इन विट्रो अध्ययन में कई दिखा दिया है कि बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) कहनेवाला संचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जीवित कोशिकाओं लगातार पुटिकाओं जो आकार, सामग्री और जीवजनन में अलग बहाया। सबसे अच्छा अध्ययन ईवीएस exosomes जो endosomal प्रणाली से उत्पन्न जहां वे Multivesicular निकायों में intraluminal पुटिकाओं के रूप में जमा कर रहे हैं। एक बार प्लाज्मा झिल्ली के साथ बाद फ्यूज, निहित पुटिकाओं exosomes के रूप में जारी किया जाता है (Exos, व्यास 30 – 100 एनएम 1)। जो प्लाज्मा झिल्ली 2 से सीधे बंद कली – EV जो पिछले वर्षों में बढ़ती ध्यान प्राप्त की है के एक दूसरे आबादी बड़े microvesicles (1000 एनएम MVS, व्यास 100) हैं।
पुटिकाओं के दोनों प्रकार के एक लिपिड bilayer से घिरा हुआ है और न्यूक्लिक एसिड होते हैं, जैसे, डीएनए, mRNA या miRNA 3 – 5, और प्रोटीन है जो वे पड़ोसी ग के लिए हस्तांतरण कर सकते हैं की एक बहुतायतएल। जबकि सामान्य में पुटिकाओं की प्रोटीन संरचना मूल के सेल की स्थिति को दर्शाता है, कुछ प्रोटीन चुनिंदा लक्षित और ईवीएस 1 पर समृद्ध होने लगते हैं। एक प्रमुख अनुसंधान ब्याज आदेश विशिष्ट ईवी हस्ताक्षर जो उपन्यास बायोमार्कर के रूप में ईवीएस के उपयोग की अनुमति सकता है परिभाषित करने के लिए असामान्य और रोगग्रस्त कोशिकाओं से ईवीएस को चिह्नित करने के लिए है। विशेष रूप से कैंसर, जिसमें अक्सर ट्यूमर ही आसानी से सुलभ नहीं है, तरल रक्त में ट्यूमर विशिष्ट ईवीएस को निशाना बायोप्सी चिकित्सा प्रतिक्रियाओं की निगरानी की अनुमति या आक्रामक प्रक्रियाओं 6 के लिए आवश्यकता के बिना प्राथमिक ट्यूमर निस्र्पक मदद कर सकता है।
दरअसल, ईवीएस पहले से ही सफलतापूर्वक मूत्र 7, 8 सीएसएफ, मां के दूध 9 या रक्त 10 सहित विभिन्न शरीर के तरल पदार्थ से पृथक किया गया है। कई अध्ययनों से अलग मानव रोगों में ईवी मायने में परिवर्तन और संरचना की पहचान की। उदाहरण के लिए, पूति रोगियों में समर्थक कौयगुलांट MVS की संख्या हैकाफी स्वस्थ व्यक्तियों 11 की तुलना में वृद्धि हुई है। इसके अलावा गंभीर सेरेब्रल मलेरिया से पीड़ित रोगियों में रक्त में कुल MVS में वृद्धि मनाया जा सकता है और प्लेटलेट व्युत्पन्न MVS की गिनती कोमा गहराई और थ्रोम्बोसाइटोपेनिया 12 के साथ सहसंबंधी। अन्य अध्ययनों, प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष या दिल की विफलता के साथ रोगियों में और बाद के मामले में endothelium व्युत्पन्न पुटिकाओं का ऊंचा संख्या रिपोर्ट इस हृदय की घटनाओं 13,14 के एक उच्च संभावना के साथ संबद्ध।
विशेष रूप से कैंसर, रक्त में ईवीएस वर्तमान में नैदानिक और शकुन मूल्य के साथ उपन्यास बायोमार्कर के रूप में चर्चा कर रहे हैं। ऐसे MUC1, EGFR या FAK के रूप में ट्यूमर जुड़े प्रोटीन व्यक्त MVS के स्तर स्तन कैंसर के रोगियों के रक्त में 15,16 बुलंद होने लगते हैं। इसके अलावा Exos के लिए, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि रक्त प्राप्त इस तरह के Glypican -1 अग्नाशय के कैंसर या डेल -1 स्तन कैंसर के लिए जल्दी रोग डी की अनुमति देने के लिए के रूप में ट्यूमर विशिष्ट एंटीजन ले जाने Exosउच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ 17,18 tection। इसके अतिरिक्त, सीरम व्युत्पन्न ट्यूमर Exos डीएनए जो इस तरह के KRAS और P53 जो चिकित्सा भविष्यवाणी 19 के लिए उनके उपयोग का सुझाव के रूप में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है हो सकता है। हाल के अग्रिमों एक विशिष्ट microfluidic चिप का उपयोग कर ग्लियोब्लास्टोमा रोगियों के रक्त में Exos की है कि विश्लेषण चिकित्सा 20 की निगरानी की अनुमति देता दिखाई है। साथ में ले ली, इन निष्कर्षों मतलब है कि पुटिकाओं के रोग विशिष्ट उप-जनसंख्या के विश्लेषण के निदान, रोग का निदान के साथ ही चिकित्सकीय विकल्प और सफलता के बारे में बहुमूल्य जानकारी देता है।
हालांकि, खून से अलगाव और Exos का विश्लेषण, समय लेने वाली है विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है और इसलिए अभी तक नियमित नैदानिक निदान के लिए अनुकूल नहीं है। इसके विपरीत, MVS बहुत तेजी से अपने बड़े आकार के कारण आसानी से प्रवाह से विश्लेषण किया जा सकता cytometry लेटेक्स मोती करने के लिए उन्हें कुछ करने के लिए आवश्यकता के बिना अलग किया जा सकता है और, यह Exos 18 के लिए आवश्यक है के रूप में21। इस प्रकार, यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि रक्त के नमूनों से MVS के मानकीकृत अलगाव और प्रवाह cytometry द्वारा एमवी उप-जनसंख्या के बाद के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल आगे के अध्ययन और बड़े रोगी समूहों में एमवी प्रोफाइल जो आदेश रोजमर्रा के नैदानिक निदान के लिए MVS का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो जाएगा की गहराई में लक्षण वर्णन की अनुमति देगा।
रक्त में ईवीएस पर हाल के अध्ययनों से दिखा दिया है कि ईवी संरचना और मायने रखता है कई बीमारियों का कारण दौरान बदल जाते हैं। इसलिए, विश्लेषण और इन ईवीएस के आगे लक्षण वर्णन आगे निदान और रोग का निदान के लिए रोग बायोमार्कर के रूप में अपनी क्षमता का उपयोग आकलन करने के लिए या चिकित्सा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए उच्च ब्याज की हैं। प्रोटोकॉल हम यहाँ पेश अप करने के लिए 600 एनएम जो किसी भी सेल organelles शामिल नहीं है की एक व्यास के साथ पुटिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है। इन टिप्पणियों MVS की वर्तमान परिभाषा के साथ लाइन में हैं और apoptotic निकायों 2 की उपस्थिति को बाहर। पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करना, हम दिखाना है कि पृथक MVS ट्यूबिलिन के एक उच्च अभिव्यक्ति दिखाने में सक्षम थे, जबकि tetraspanins CD9 और CD81 है कि अक्सर Exo मार्कर के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं केवल थोड़ा व्यक्त किया गया। इस बात की पुष्टि करता है कि MVS Exos से अलग और प्रोटिओमिक्स 25 द्वारा हाल ही में गहराई लक्षण और दोनों ईवी आबादी की तुलना करने के लिए फिट बैठता है।
सामग्री "> रक्त के नमूनों के अधिग्रहण के दौरान यह आदेश एमवी गिरावट को रोकने के लिए venipuncture और प्लाज्मा तैयारी के बीच के समय को रखने के लिए के रूप में कम संभव के रूप में महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, रक्त के नमूनों की लंबे समय तक भंडारण बढ़ाया एमवी के कारण रक्त कोशिकाओं की सक्रियता को ले जा सकता है apoptosis जो apoptotic निकायों की रिहाई में परिणाम बहा और अंततः। एमवी अलगाव के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण विचार। प्लाज्मा प्रोटीन या छोटे Exos साथ एमवी तैयारी के संदूषण को रोकने के लिए है, इसलिए, यह नीचे कताई के बाद संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है पर 14,000 एक्स जी MVS। चूंकि गोली सामान्य रूप से दिखाई दे रहा है और कसकर ट्यूब की दीवार से जुड़ी है, सतह पर तैरनेवाला आसानी से एक विंदुक टिप के साथ हटाया जा सकता है। Exos के विपरीत है जो उच्च गति ultracentrifugation और तैयारी के दौरान समुच्चय के रूप में लिए जाते हैं अक्सर resuspend करने के लिए मेहनत कर रहे हैं, इस समस्या MVS के साथ नहीं होती है।हमारे अध्ययन से पता चलता है कि यह possi हैएमवी उप-जनसंख्या से फ्लो द्वारा रक्त में मौजूद चिह्नित करने के लिए ble। हालांकि सबसे प्रवाह cytometers का पता लगाने सीमा के आसपास 200 – 300 एनएम, MVS reproducibly दाता के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण का एक ही मापदंड और फाटकों कि स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि संकेतों से उनकी भेद अनुमति के साथ सेल संस्कृति के नमूनों में मापा गया। यह माप है कि पीबीएस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किसी भी दूषित कणों कि प्रवाह cytometry (चित्रा 3) के दौरान एक उच्च पृष्ठभूमि का कारण बन सकता शामिल नहीं करता है से पहले सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ छोटे MVS एक प्रवाह cytometric दृष्टिकोण में कब्जा नहीं किया जा सकता है, हम सभी प्रमुख रक्त कोशिका आबादी (जैसे, प्लेटलेट्स, लाल रक्त कोशिकाओं, ल्यूकोसाइट्स, endothelial कोशिकाओं) से MVS का पता चला। 29 – हमारे विश्लेषण में हम अलग रक्त कोशिकाओं है कि पहले MVS 26 पर पाया गया के लिए मानक मार्कर का इस्तेमाल किया। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आदेश प्रवाह cytometry द्वारा सर्वोत्तम संभव परिणाम प्राप्त करने के लिए, टी मेंवह राशि और सभी एंटीबॉडी की एकाग्रता एक एमवी नमूना ब्याज की प्रतिजन व्यक्त पर titrated किया जाना चाहिए। रक्त में विशिष्ट एमवी उप-जनसंख्या उच्च विशिष्टता के साथ की पहचान की जाएगी, तो यह संबंधित MVS पर दो अलग अलग एंटीजन वर्तमान के खिलाफ डबल धुंधला प्रदर्शन करने के लिए और केवल सभी डबल सकारात्मक MVS पर विचार बाद के विश्लेषण के लिए 23 संभव है। वर्तमान में, वहाँ स्वस्थ व्यक्तियों 23,30 के रक्त में एमवी उप-जनसंख्या का एक मानक सीमा को परिभाषित करने के लिए प्रयास कर रहे हैं। इन अध्ययनों से पता चला है कि पहले से ही प्लेटलेट व्युत्पन्न MVS खून जो हमारी टिप्पणियों के साथ पत्राचार में है में MVS की सबसे बड़ी आबादी का गठन।
प्रवाह cytometry एमवी नमूनों को चिह्नित करने का एक फायदा यह है कि इस विधि को पहले से ही अच्छी तरह से सबसे नैदानिक केन्द्रों में नैदानिक प्रयोजनों जो रोजमर्रा नैदानिक निदान में बायोमार्कर के रूप में MVS के संभावित उपयोग की अनुमति होगी के लिए स्थापित किया गया है। रक्त में ईवीएस पर पिछले अध्ययनों जो ज्यादातर ध्यान केंद्रित किया हैएड छोटे Exos पर, या तो विशिष्ट छँटाई प्रक्रियाओं पर भरोसा चुनिंदा वांछित Exo लक्ष्य आबादी 31,32 का विश्लेषण करने के लिए या एक समय लेने वाली (2 दिन) अलगाव Exos के युग्मन के साथ इस प्रक्रिया की आवश्यकता विश्लेषण 18 से पहले मोती लेटेक्स करने के लिए। हमारी अपनी अप्रकाशित टिप्पणियों का सुझाव है कि पूरे रक्त की तैयारियों से MVS के प्रवाह cytometric विश्लेषण भी इस तरह के किसी भी तरह के चयन प्रक्रिया के बिना ट्यूमर व्युत्पन्न MVS के रूप में MVS का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।
साथ में ले ली, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ परिधीय रक्त के नमूनों से MVS के तेजी से अलगाव की अनुमति देता है और उनके बाद लक्षण वर्णन प्रवाह cytometry और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर। पूरी प्रक्रिया में लगभग 2 घंटे, जो मरीजों के खून में एमवी प्रोफाइल है कि रोग बायोमार्कर के रूप में MVS की क्षमता का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा होगी किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).
butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5µl for staining |
CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5µl for staining |
CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8µg for staining |
CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1µg for staining |
CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56°C) |
filter 0.22µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5000 in 5%BSA in TBST |
ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 |