Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning
Summary
Ardışık kriyo-bölümleri tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ekspresyonu ölçümleri için histolojik uygulamalar ve RNA zenginleştirme sağlamak için toplanır. doğrudan uygulamalar arasında karşılaştırılmıştır toplanmış cryosections ve ölçümlerin 30 mg – Yüksek kaliteli RNA 20 elde edilir.
Abstract
Bu yöntem ile, birbirini takip eden cryosections tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ifadesi için doku histolojisi ve RNA zenginleştirilmesi için, her iki mikroskop uygulamaları sağlamak için toplanır. Tipik olarak, tampon hacimleri verimli taşlama uygulamaları için çok düşük olabilir, çünkü henüz yeterli mekanik kesinti olmadan, küçük iskelet kas örneklerinin yeterli homojenizasyonu sağlamak için zorlu, tampon reaktif kas sınırları penetrasyon yoğun doku mimarisi, sonuçta düşük RNA verim neden olur. Burada bildirilen protokolü takip ederek, 30 mikron kesitler toplanır ve tampon penetrasyonu maruz yüzey alanını arttırarak, krio-bölümleme ve sonraki iğne homojenizasyon kas bozabilir mekanik izin toplanmış. tekniğin başlıca kısıtlamaları bir kriyostat gerektirir, ve nispeten düşük bir kapasiteye sahip olmasıdır. Bununla birlikte, yüksek-kalitede RNA toplanmış m küçük örnekler elde edilebiliruscle cryosections, birçok farklı iskelet kaslarında ve diğer dokular için bu yöntem erişilebilir hale getirmek. Ayrıca bu teknik eşleşti sağlayan analizler (örneğin, doku histopatolojik ve gen ifadesi) ölçümleri doğrudan deneysel belirsizliği azaltmak ve küçük bir doku kaynak için gerekli replikatif hayvan deneyleri azaltmak için uygulamalar arasında mukayese edilebilir, böylece tek bir iskelet kası komşu bölgelerden birden çok uygulama.
Introduction
Bu tekniğin amacı, tek bir küçük iskelet kası kaynak dokusundan erişilebilir gibi histoloji ve gen ifadesi olarak farklı modaliteleri, birden fazla deneysel analiz yapmaktır. Mikroskopi uygulamaları dikkatle dondurulması sırasında buz kristali eserler oluşumunu sınırlamak için kontrol edilmelidir koruma yöntemleri, örnek en duyarlıdır. Böylece, yöntem geliştirme tibialis anterior dayanmaktadır (TA) kas kısmen immünfloresan mikroskopi ve gen ifadesi hem analizleri için kaynak materyal olarak -140 ° C sıvı nitrojen soğutmalı 2-metilbütan banyosunda reçine gömme ile kaplı dondurulmuş.
çeşitli teknik yaklaşımlar için aynı kaynak materyal kullanma ihtiyacı sol ve sağ kaslar farklı koşullar, deneysel ve tek kontrol temsil eden kas içi enjeksiyon tabanlı deneyler için özellikle önemlidir. Örneğin, kas yenilenmesi çalışmalarında, tek bir muSistemik lupus karşı kas aracı ile enjekte edilmiş kontrol 1 olarak hizmet ederken yaygın doku hasarına neden olmak için, bir toksin ile enjekte edilir. Benzer bir şekilde, kas Gen tedavisi yapılan çalışmalarda genellikle karşı tarafa 2 boş vektör olmayan vektör veya taşıyıcı kontrol ile karşılaştırıldığında gereken kas içine enjeksiyon ile gen terapi vektörünün doğrulama ile başlar. Nedenle, farklı bir uygulama için her bir ta kas kaynak yapmak mümkün değildir.
Bu konu ile ilgili ortak stratejiler şunlardır: i) ii) Ek fareler kullanmak, veya iii) her uygulama için kas bir parça kesmek için, her uygulama için farklı bir kas grubunu kullanmak için. Ancak, kas grupları arasında önemli farklılıklar zor ayrı uygulamalardan verileri karşılaştırmak için yapmak ve ek hayvanlar gider artırmak ve diğer alternatifler varsa kötü haklı. farklı uygulamalar kaynak diseksiyonu sonrası kas bölme en iyi seçenek in birçok durumda. Bununla birlikte, kas parçalar genellikle homojenleştirme 2-5 için sıvı azot ya da mekanik öğütme teknikleri altında toz haline kullanmak için çok küçüktür. kas hücre dışı matris ve kontraktil proteinlerin ile kaplı olan bir yüksek yapısal doku gibi, yetersiz mekanik homojenleştirme daha sonra, DNA, RNA ya da protein düşük verime yol açar. Burada açıklanan yöntem çoklu uygulamalarda kullanılacak bir kaynak kas dokusunun küçük miktarlarda sağlar ve krio-bölümleme ve iğne toz haline dahil iyi RNA verimi için mekanik homojenizasyon artırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
fazlalık reçine toplanmış cryosections toplanması yavaş olacak ve RNA izolasyonu reçine kirlenme gömme artabilir, çünkü bu yöntem ile en iyi sonuçları elde etmek için, doku kriyoprezervasyon sırasında kas alt üçüncü ya da yarısına sınırlı reçine gömme tutun. Ayrıca, iğne homojenizasyon sırasında dikkatli dikkat verimi en üst düzeye çıkarmak ve iğneyi tıkanma olasılığını en aza indirmek için önemlidir. protokol iğne bloke ve yapışmasına neden çıkarmak için yüksek bası…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
Referências
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049 (2016).
- Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
- Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
- Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
- Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
- Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
- Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
- Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20 (2015).
- Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
- Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
- Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
- Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
