Méthodologie de l'étude du transfert horizontal de gènes dans<em> Staphylococcus aureus</em
Summary
Nous décrivons ici trois protocoles différents pour l'enquête in vitro de la conjugaison, la transduction et la transformation naturelle de Staphylococcus aureus.
Abstract
Une caractéristique importante de la principale pathogène humain opportuniste Staphylococcus aureus est son extraordinaire capacité à acquérir rapidement une résistance aux antibiotiques. Les études génomiques révèlent que S. aureus comporte de nombreux gènes de virulence et de résistance situées dans des éléments génétiques mobiles, ce qui suggère que le transfert horizontal de gènes (HGT) joue un rôle essentiel dans l' évolution de S. aureus. Cependant, une description complète et détaillée de la méthodologie utilisée pour étudier HGT à S. aureus qui manque encore, en particulier en ce qui concerne la transformation naturelle, qui a été récemment rapporté dans cette bactérie. Ce travail décrit trois protocoles qui sont utiles pour l'enquête in vitro de HGT à S. aureus: la conjugaison, la transduction du phage, et la transformation naturelle. Dans ce but, le gène cfr (chloramphénicol / résistance à la florfénicol), qui confère aux phénicols, Lincosamides, oxazolidinones, pleuromutilines et la streptogramine A (PhLOPSA) -résistance phénotype a été utilisé. Comprendre les mécanismes par lesquels S. aureus transfère le matériel génétique à d' autres souches est essentielle pour comprendre l'acquisition rapide de la résistance et aide à clarifier les modes de diffusion déclarés dans les programmes de surveillance ou pour prévoir en outre le mode d' étalement dans le futur.
Introduction
Staphylococcus aureus est une bactérie à Gram positif commensal qui habite naturellement la cavité de la peau et du nez des êtres humains et des animaux. Cette espèce bactérienne est la principale cause des infections nosocomiales dans les hôpitaux et les établissements de santé. De plus, sa capacité à développer une résistance aux différents composés antimicrobiens a fait de la gestion des infections causées par cette bactérie dans une préoccupation mondiale.
Deux principales voies impliquées dans la propagation des phénotypes de résistance sont connus: la diffusion clonale de génotypes résistants et la diffusion des déterminants génétiques entre la piscine bactérienne. Dans le cas de S. aureus, les différents gènes de résistance aux antibiotiques (ainsi que les déterminants de la virulence) se sont révélés être associés à des éléments génétiques mobiles (1) MGES. La présence de ces éléments dans le génome de S. aureus indique que l'acquisition et le transfert de génmatériau étique au sein de la population bactérienne pourrait jouer un rôle important pour S. aureus adaptation et d' évolution.
Le matériel génétique peut être échangé par le biais de trois mécanismes bien connus de HGT dans les bactéries Gram-positives: la transformation, la conjugaison et la transduction du phage. La transformation implique l'absorption de l'ADN libre. Pour acquérir de l'ADN étranger, les cellules bactériennes ont besoin de développer une phase physiologique particulière: le stade de la compétence. Lorsque cette étape est atteinte, les cellules compétentes sont capables de transporter l'ADN dans le cytoplasme, l'acquisition de nouveaux déterminants génétiques. Dans le cas de S. aureus, l'existence de la transformation naturelle a été démontrée récemment 2. Conformément à cela, notre groupe a mis en lumière la pertinence de l'expression du facteur de SigH (une transcription secondaire facteur sigma cryptique) au stade de la compétence du développement et sur la façon dont son expression constitutive rend S. aureus capable de reaching stade de la compétence, qui permet l'acquisition de phénotypes résistants par transformation naturelle 2.
Conjugaison est un processus impliquant la transmission de l'ADN d'une cellule vivante (donneur) à un autre (receveur). Ces deux cellules doivent être en contact direct, permettant à l'ADN à échanger tout en étant protégés par des structures spéciales, telles que des tubes ou des pores. Le transfert de l'ADN par ce procédé nécessite la machine conjugatif. Chez S. aureus, le plasmide prototype conjugatif est PGO1, qui abrite l'opéron conjugatif Traa 3.
Phagique transduction implique le transfert d'ADN d'une cellule à une infection par bactériophage et implique le garnissage de l'ADN bactérien, au lieu de l'ADN viral dans la capside de phage. La plupart des isolats de S. aureus sont lysogénées par bactériophages 1. Des conditions de stress, prophages peuvent être excisées à partir du génome bactériene et le décalage du cycle lytique.
Ce sont les trois mécanismes bien connus pour la transmission de l' ADN de S. aureus. Il y a des mécanismes de transfert supplémentaires, tels que des «pseudo-transformation" 2 et les systèmes de phages comme dans le transfert des îlots de pathogénicité 4. Récemment, un groupe a rapporté que «nanotubes» sont impliqués dans le transfert de matériaux cellulaires (y compris l' ADN plasmidique) entre les cellules voisines 5, 6, mais une étude de suivi n'a pas paru d'autres groupes jusqu'à présent.
Ce travail fournit la méthodologie nécessaire pour étudier HGT à S. aureus en abordant les trois principales voies de transfert: conjugaison, la transduction et la transformation naturelle. Les résultats obtenus avec ces méthodes ont été utilisées pour étudier la transmission du gène cfr (chloramphénicol / résistance de florfénicol) parmiLes souches de S. aureus 7. Ces trois techniques sont des outils polyvalents pour l'enquête de la transmission MGE à S. aureus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce travail décrit les trois méthodes principales pour étudier la HGT des déterminants génétiques de S. aureus. Bien que la transduction et la conjugaison ont été étudiés depuis des décennies, l'existence de la transformation naturelle a été récemment reconnue 2. Ainsi, S. aureus est équipé de tous les trois principaux modes de HGT, et de tester chacun d'entre eux est nécessaire pour clarifier les voies de diffusion possibles des déterminants gén?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
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