Analysere gunstige effektene av kosttilskudd på Intestinal Epitelial barrierefunksjoner Under Experimental kolitt

Summary

Dagens behandling av inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) tar sikte på å lindre sykdom symptomer, men kan forårsake alvorlige bivirkninger. Dermed blir alternative strategier blir undersøkt i dyre kolitt modeller. Her forklarer vi hvordan de gunstige effektene av kosttilskudd på kliniske IBD skiltene er analysert i en slik kolitt modell.

Abstract

Inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), inkludert Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, er kronisk tilbakevendende sykdommer i tarmene. De forårsaker alvorlige problemer, for eksempel magekramper, blodig diaré, og vekttap, i berørte personer. Dessverre er det ingen kur ennå, og behandlinger bare tar sikte på å lindre symptomene. Aktuelle behandlinger inkluderer anti-inflammatorisk og immundempende medikamenter som kan forårsake alvorlige bivirkninger. Dette garanterer jakten på alternative behandlingstilbud, for eksempel kosttilskudd, som ikke forårsaker bivirkninger. Før sin søknad i kliniske studier, må slike forbindelser bli grundig testet for effektivitet og sikkerhet i dyremodeller. En pålitelig eksperimentell modell er dekstransulfat natrium (DSS) kolitt-modell i mus, som gjengir mange av de kliniske tegn på ulcerøs kolitt hos mennesker. Vi har nylig brukt denne modellen for å teste den reelle effekten av et kosttilskudd som inneholdervitamin C og E, L-arginin og co 3-flerumettede fettsyrer (PUFA). Vi analyserte forskjellige sykdomsparametre og fant at dette tillegget var i stand til å lindre ødemdannelse, vevsskade, leukocytt infiltrering, oksidativt stress, og produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner, fører til en generell forbedring i sykdomsaktivitetsindeks. I denne artikkelen forklarer vi i detalj korrekt anvendelse av kosttilskudd bruker DSS kolitt modell i C57BL / 6 mus, samt hvordan sykdomsparametre som histologi, oksidativt stress og betennelse vurderes. Analysere de gunstige effektene av ulike kosttilskudd kan deretter eventuelt åpne nye veier for utvikling av alternative behandlingsstrategier som lindrer IBD symptomer og / eller som forlenger faser av remisjon uten å forårsake alvorlige bivirkninger.

Introduction

Kolitt er en betennelsestilstand i tykktarmen som kan forårsake diaré og magesmerter. Kolitt kan være akutt, som respons på infeksjon eller stress, eller det kan utvikle seg som en kronisk sykdom, slik som i ulcerøs kolitt (UC), som tilhører gruppen av inflammatoriske tarmsykdommer (IBD). Selv om kliniske tegn på UC er godt beskrevet, er patogenesen fortsatt dårlig forstått ^en. Det er akseptert blant eksperter at UC er en multifaktoriell sykdom, med genetiske mutasjoner og avvikende immunresponser som spiller en stor rolle ^2. Men miljøfaktorer som livsstil og ernæring, også bidra til sykdomsutvikling og progresjon ^tre.

Dessverre er IBD ikke kureres, men det er mange behandlingstilbud som tar sikte på å lindre kliniske symptomer. Aktuelle behandlinger inkluderer anti-inflammatorisk narkotika, for eksempel sulfasalazin og kortikosteroider; immunsuppressive midler, slik som azathioPrine; monoklonale antistoffer som bevarer pro-inflammatoriske cytokiner, slik som tumornekrosefaktor-α (TNF-α), eller blokkere adhesjonsmolekyler, slik som integriner, for å redusere overdreven leukocytt-rekruttering; og hemmere som er rettet mot kinaser som utløser proinflammatoriske trasé, slik som Janus kinase (JAK) ^4. Ikke alle pasienter svare på alle behandlinger, så terapeutiske strategier må individualiseres ^5. Videre er de fleste av disse terapeutiske legemidler interfererer med metabolismen og immunresponser, ofte forårsaker alvorlige bivirkninger. Av denne grunn har alternative behandlingstilbud blitt undersøkt.

Alternative behandlinger inkluderer probiotika og kosttilskudd, som er anvendt i dyremodeller og kliniske forsøk med varierende grad av suksess ^6,7. Vi har nylig funnet ut at anvendelsen av ulike enkelt kosttilskudd, slik som anti-oksidative vitaminer eller ω3-poly-umettede fettsyrer (PUFAs), er dårligere enn bruk av en kombinasjon av slike tilskudd i å lindre kolitt og kardiovaskulær sykdom symptomer ^8,9. Disse studiene ble utført i mus, så kliniske studier må utføres i mennesker for å bestemme hvorvidt disse funn vil også være anvendelig for mennesker. Før kliniske studier er igangsatt, må effektiviteten og sikkerheten av nye behandlingsalternativer vurderes i dyremodeller.

For IBD har dekstransulfat natrium (DSS) modellen er mye brukt til å studere mekanismer for sykdomsutvikling og de gunstige effektene av legemidler og kosttilskudd ^6,10. I de fleste studiene, bare en akutt sykdom i løpet av et tidsrom på syv dager blir indusert; Likevel, de kliniske tegn observert i disse dyrene ligner de som ble observert i IBD pasienter (dvs. blodig diaré, vekttap, epithelial dysfunksjon, og immuncelleinfiltrasjon) ^10. DSS induserer erosjoner i slimhinnene,resulterer i barriere dysfunksjon og økt intestinal epitel permeabilitet ^11. Den eksakte mekanisme er ukjent. Imidlertid tyder en studie som DSS samhandler med middels kjedelengde fettsyrer for å danne nano lipocomplexes som er i stand til å gå inn epitelceller og å indusere inflammatoriske signalveier ^12. I denne artikkelen beskriver vi i detalj hvordan kolitt indusert og analysert hos mus, hvordan ernæringstilskudd er brukt av sonde for å sikre en konstant dose i hvert dyr, og hvordan virkningene av slike kosttilskudd på ulike kolitt symptomer er undersøkt.

Protocol

Alle dyreforsøk har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Cinvestav. 1. Utarbeidelse av DSS drikkevann og induksjon av kolitt Tilbered en 3,5% w / v dekstransulfat natrium (DSS) løsning i Autoclaved drikkevann. DSS oppløses lett og det er ikke nødvendig å filtrere den endelige løsningen. MERK: 7 dager DSS behandling induserer alvorlig kolitt. Hvis indusere mild kolitt, 3 – er 4 dagers behandling anbefales. Så lenge DSS drikkevannet holder seg klart, er det ikke nød…

Representative Results

Diet Supplements kan beskytte fra DSS kolitt Anti-inflammatorisk og anti-oksidative kosttilskudd, slik som vitamin C, vitamin E, nitrogenoksid (NO) -source L-arginin og co 3-flerumettede fettsyrer (PUFA-ro3), er blitt anvendt med varierende suksess i dyr modeller for å lindre symptomer på inflammatoriske sykdommer 3,6,15. Underernæring, oksidativt stress, og produksjonen av proinflammatoriske cytokiner kan utløse b…

Discussion

For å bruke kosttilskudd i kliniske studier, må fordelene og sikkerheten av slike tilskudd vurderes nøye in vivo i dyrestudier. I tilfelle av kolitt, har flere egnede dyremodeller som ligner de kliniske symptomer på IBD er etablert, inkludert kjemiske modeller ved hjelp av DSS, TNBS, eller eddiksyre; knock-out (KO) modeller som IL10-KO; og immun-celle-mediert kolitt ved hjelp av adoptiv T-celle overføring ^19-21. DSS modell av kolitt er en hurtig og pålitelig metode for å indusere kolitt som li…

Materials

0.3% of gelatin	Bioxon	158
10% formaldehyde	J.T. Baker	2106-03
96-well plate with flat bottom	Corning	3368
Absolute ethanol	J.T. Baker	9000-03
Absolute xylene	J.T. Baker	9490-03
ABTS	Sigma Aldrich	H5882
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8
ColoScreen	Helena Laboratories	5072
Corabion (Kindly provided by Merck, Naucalpan, Mexico)	Merck
Dextran Sulfate Sodium Salt	Affymetrix	9011-18-1	(M.W. 40,000-50,000)
Dihydroethidium	Life Technology	D11347
Eosin-Y	J.T. Baker	L087-03
Evans blue	Sigma-Aldrich	314-13-6
Feeding  needle	Cadence Science Inc.	9921
Glass slide rack with handle	Electron Microscopy	70312-16
Glass Slides	Corning	2947
Harris hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hexadecyltrimethyammonium (HTAB)	Sigma Aldrich	H6269
Histosette (Embedding cassette)	Simport	M498.2
Hydrochloric acid 1 M	J.T. Baker	9535-62
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H3410
Ketamine	PiSA Agropecuaria	Q-7833-028
Liquid paraffin	Paraplast	39501-006
Lithium carbonate	Sigma-Aldrich	2362
N,N-dimethylformamide	J.T. Baker	68-12-2
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Plastic cubes	Electron Microscopy	70181
Poly-L-Lysine Solution	Sigma-Aldrich	25988-63-0
Prism 5 statistical software	GraphPad Software	Prism 5
Saline Solution 0.9% NaCl	CS PiSA	Q-7833-009
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	W302600
Synthetic resin	Poly Mont	7987
Taq DNA polymerase	Invitrogen	11615-010
Tissue-tek. O.C.T Compound	Sakura Finetek	4583
Tuberculine Syringe	BD Plastipak	305945
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Xylazine	PiSA Agropecuaria	Q-7833-099