ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע
Summary
שמרי הביקוע, שמר החלוקה היא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis, השלב הסופי חלוקת תא. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופ לנתח אירועים cytokinetic שונים בתאי שמרים ביקוע חי.
Abstract
Cytokinesis, השלב האחרון חלוקת תא הוא קריטי לשמירה על שלמות הגנום. cytokinesis נכונה חשובה התמיינות תאים ופיתוח. Cytokinesis כולל סדרה של אירועים שמאורגנים היטב בזמן ובמרחב. Cytokinesis כרוך ההיווצרות של טבעת actomyosin באתר החלוק, ואחריו התכווצות טבעת, היווצרות תלם הממברנה שיפוץ מטריצה חוץ-תאי. שמרי הביקוע, שמר החלוקה (pombe ס) הוא מערכת מודל למדה היטב כי חשפה בבהירות ניכרת האירועים הראשוניים cytokinesis. עם זאת, אנחנו לא מבינים בבירור עד כמה שונים אירועי cytokinetic מתואמים spatiotemporally. כדי לבדוק זאת, יש צורך לנתח את אירועי cytokinetic השונים בפרטים גדולים בזמן והן במרחב. כאן אנו מתארים גישת מיקרוסקופיה לבחון ev השונה cytokineticהמציג בתאים חיים. עם גישה זו אפשר לתזמן אירועים cytokinetic שונים לקבוע את מועד הגיוס של חלבונים שונים במהלך cytokinesis. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקולים להשוות לוקליזציה חלבון, והפצה באתר של חלוקת התא. זהו פרוטוקול בסיסי ללמוד cytokinesis בשמרי ביקוע ויכולים לשמש גם עבור שמרים אחרים ומערכות פטרייתי.
Introduction
Cytokinesis, השלב האחרון חלוקת תא, הוא חיוני תהליך מורכב לבידול נכון, פיתוח, והישרדות של אורגניזם. Cytokinesis כרוך אירועים מרובים, מבעוד מועד, להבטיח הפרדת תא מוצלחת תוך שמירה על שלמות הגנומי 1. Cytokinesis כרוך אירועים שבו טבעת actomyosin פעם התאספה עוברת מועקה, שהוא בו זמנית עם התרחבות קרום וחורש, שיפוץ מטריצה הסלולר תאי, ולבסוף ואחריו תא כריתה 1, 2, 3. ארגון נכון של אירועי cytokinetic יכול להוביל למומי הפרדת ploidy תא, ועלול לגרום למחלות כמו הסרטן 4, 5, 6, 7, 8. עקרונות היסוד המאפשרים organization של אירועים cytokinetic אינם מובנים היטב, ובכך מובילה מחסומים בהבנתנו את האטיולוגיה של מחלות אלו.
שמר החלוקה שמרים ביקוע (pombe ס) הוא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis בשל האופי המשומר של חלבוני המעורבים 1. בשמרי ביקוע, לאחר actomyosin הרכבת טבעת, הטבעת נכנסת לשלב התבגרות / להתעכב שם זה לא להצר 9. הבשלה מסתיימת חניכה של מועקת טבעת actomyosin, במקביל תִלוּם הממברנה ingression מחץ. זרעי עבודה לאורך השנים נתנה לנו הבנה טובה למדי של טבעת הרכבת actomyosin ב ביקוע שמרים 1, 9, 10. אאוקריוטים מסוימים, כולל שמרים ביקוע, הרכבה מוצלחת של טבעת actomyosin אינו מספיק עבור תִלוּם הממברנה. ב fשמרים ission, כיווץ טבעת לבדו אינו מספק כוח מספיק כדי להתגבר על לחץ טורגור פנימי תלם היווצרות 11. הדגם אחרון עולה כי כוח זה מסופק במקום על ידי ingression מחץ 11. במודל אחר, את התפקיד של רחבת קרום הפלזמה הוצע לתרום תלם היווצרות 12, 13. התכווצות טבעת וחורשת קרום אינם מתרחשים cps1-191 מוטציה רגיש הטמפרטורה Bgs1 / CPS1, האנזים העיקרי להיווצרות מחצה העיקרי 14, 15. תאים חסרי Bgs1 להראות מחצה העיקרי פגום התכווצות טבעת ממושכת 15, 16. Bgs1 מגויסת לאתר חלוקת התא עבור ingression מחצה במהלך ההבשלה לאחר actomyosin טבעת הרכבה 17, 18. Similarly, במהלך cellularization בעוברים תסיסנית, כיווץ טבעת הוא biphasic עם שיעור התכווצות ראשוני איטי באופן משמעותי 19, שמזכיר את שלב ההבשלה שנצפה שמרי ביקוע. התכווצות טבעת Biphasic עשויה להאט תִלוּם הממברנה כדי לאפשר התרחבות קרום מספיק 20 ושינוי של מטריקס. הדבר מצביע על כך לאחר actomyosin טבעת הרכבה, כיווץ טבעת מתרחש ביעילות רק כאשר התא עמד בדרישות להיווצרות קמט. זה אינו מובן היטב מה תנאים נדרשים לתעוקת actomyosin טבעת לאחר הרכבת טבעת, ולא האירועים המולקולריים לווסת את התהליך הזה. הראינו לאחרונה כי בעקבות טבעת actomyosin ההרכבה Cdc42 GTPase הקטן עובר דפוס הפעלת spatiotemporal ייחודי 21. דפוס זה היא הוקמה על ידי דפוס הלוקליזציה הייחודי של גורמי חליפי נוקלאוטיד guanidine Cdc42 (GEFs) המפעילים Cdc42. GEF Gef1 localizes לזירת actomyosin התאספה ומקדמת הופעת התכווצות טבעת ingression מחץ, בעוד Scd1 localizes הקרום המקמט ומקדם היווצרות מחצה נורמלית. אנו מוצאים כי דפוס הפעלת Cdc42 שהקים GEFs שלה להוביל הסדרת אירועי cytokinetic ברורים.
כדי להבין את המנגנון המולקולרי של אירועים שבסופו של דבר להוביל לפרידת התא הבא טבעת הרכבת actomyosin, צריך לעקוב אחר אירועי cytokinetic ברורים בזמן ובמרחב. בשמרים ביקוע, cytokinesis הראשון כולל את הרכבה של בלוטות מבשר סביב הגרעין, אשר בסופו של דבר לגייס את שרירן סוג II, formin Cdc12, וחלבונים אחרים הדרושים להרכבה טבעת actomyosin. לעת אירועי cytokinetic הברורים ולספק מסגרת ההתייחסות, הפרדת סמני גוף מוט ציר (היווצרות ציר) נחשב זמן 0 22. ההרכבה של הטבעת דואר actomyosin יכול להיות מלווה ניטור לאורך זמן עוצמת חלבון טבעת fluorescently מתויג actomyosin כגון שרשרת אור רגולטוריות מסוג II שרירן Rlc1. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופית לנתח בשלבים שונים של cytokinesis לאורך זמן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן יש לנו תיאר פרוטוקול ללמוד אירועים cytokinetic בשמרים ביקוע באופן זמני. הפרוטוקול המתואר כאן מספק פתרון זמני של אירועי cytokinetic שונים תוך התייחסות לזה; עיתוי גיוס חלבון או הפסד תוך התייחסות לשלב cytokinetic; מבנה הטבעת לאורך השלבים השונים של cytokinesis; וכן את התקדמות cytokinesis בהתיי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).
Materials
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
Referências
- Pollard, T. D. Mechanics of cytokinesis in eukaryotes. Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. Cytokinesis in eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genética. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F. Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p. Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).
- . . Fission Yeast: A laboratory Manual. , (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Bioquímica. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
