Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Summary

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células humanas para analisar os fatores de iniciação da tradução que se ligam à tampa 5' do mRNA durante condições fisiológicas de oxigênio. Este método utiliza um análogo de tampa m⁷GTP ligado à agarose e é adequado para investigar fatores de ligação de tampas e seus parceiros de interação.

Abstract

O controle translacional é um ponto focal da regulação gênica, especialmente durante períodos de estresse celular. A tradução dependente de cap através do complexo eIF4F é de longe a via mais comum para iniciar a síntese de proteínas em células eucarióticas, mas variações específicas de estresse desse complexo estão surgindo agora. A purificação de proteínas de ligação à tampa com uma resina de afinidade composta de m⁷GTP ligado à agarose (um análogo da tampa de mRNA 5') é uma ferramenta útil para identificar fatores envolvidos na regulação do início da tradução. A hipóxia (baixo oxigênio) é um estresse celular encontrado durante o desenvolvimento fetal e a progressão do tumor e é altamente dependente da regulação da tradução. Além disso, foi relatado recentemente que os órgãos humanos adultos têm um teor de oxigênio mais baixo (fisioxia 1-9% de oxigênio) que está mais próximo da hipóxia do que o ar ambiente, onde as células são cultivadas rotineiramente. Com a caracterização contínua de um complexo eIF4F hipóxico (eIF4F^H), há um interesse crescente em entender o início da tradução dependente de oxigênio através da tampa de mRNA 5'. Recentemente, desenvolvemos um método de cultura de células humanas para analisar proteínas de ligação a tampas que são reguladas pela disponibilidade de oxigênio. Este protocolo enfatiza que a cultura celular e a lise sejam realizadas em uma estação de trabalho de hipóxia para eliminar a exposição ao oxigênio. As células devem ser incubadas por pelo menos 24 horas para que o meio líquido se equilibre com a atmosfera dentro da estação de trabalho. Para evitar essa limitação, meios pré-condicionados (desoxigenados) podem ser adicionados às células se forem necessários pontos de tempo mais curtos. Certas proteínas de ligação à tampa requerem interações com uma segunda base ou podem hidrolisar o m⁷GTP, portanto, alguns agentes de tampa podem ser perdidos no processo de purificação. Análogos de capa ligados à agarose enzimaticamente resistentes podem ser substituídos neste protocolo. Este método permite que o usuário identifique novos fatores de tradução regulados por oxigênio envolvidos na tradução dependente de cap.

Introduction

Controle de translação está a emergir como um passo igualmente importante para a regulação da transcrição na expressão do gene, especialmente durante períodos de estresse celular ^1. Um ponto focal de controlo de tradução é para o passo limitante da velocidade de início em que os primeiros passos da síntese de proteínas envolve a ligação do factor eucariótico de iniciação 4E (eIF4E) para o 7-metilguanosina (m ⁷ GTP) 5 'tampão de mRNAs ² . eIF4E é parte de um complexo trimérico chamado eIF4F que inclui elF4A, uma helicase de ARN, e eIF4G, uma proteína andaime necessário para o recrutamento de outros factores de tradução e os ribosso....

Protocol

1. Preparativos para Cultura de Células

1. Comprar ações disponíveis no mercado de células humanas.
   NOTA: Este protocolo utiliza carcinoma colorectal HCT116 e células primárias humanas renais proximais tubulares epiteliais (HRPTEC).
2. Adicione 500 ml de meio de cultura de HCT116: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), meio de glucose / alta suplementado com 7,5% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S).
3. Adicione 500 ml de meio de cultura de HRPTEC: meio de células epiteliais suplementado com FBS a 5%, suplemento de crescimento de células epiteliais de 1%, e 1% de P / S.
4. Preparar 500 ml de 1x ....

Results

Análise da Capacidade Cap-obrigatório em resposta a Oxygen de eIF4E e eIF4E2 em uma m ⁷ GTP de afinidade de coluna

As Figuras 1 e 2 representam Western blot de m ⁷ GTP purificação por afinidade típica de duas importantes proteínas de ligação do tampão em resposta a flutuações de oxigênio em duas linhas de células humanas: células primárias humanas renais proximais tubulares .......

Discussion

A análise de proteínas de ligação de PAC em células humanas expostas a condições fisiológicas de oxigénio pode permitir a identificação de novos factores de iniciação de tradução regulada de oxigénio. A afinidade destes factores para a tampa 5 'do mRNA ou de outras proteínas associadas a tampa pode ser medida pela força da sua associação a ⁷ m-GTP ligados esferas de agarose. Uma limitação desta técnica é que ele mede o potencial de ligação a tampa de proteínas pós-lise, mas é realizada sob condições não d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
γ-aminofenil-m7GTP agarose C10 Placa de		agarose m7GTP
100 mm	Corning	877222	10 cm Placa de
cultura de 150 mm	Thermofisher	130183	15 cm
Hidrocloro	ACROS Organics	A0356829	AEBSF
Contas de Agarose	Jena Bioscience	AC-0015	Controle de contas de agarose
Bromofenol Azul	Fisher	BP112-25	Componente do buffer de carregamento SDS-PAGE
1,5 ml Tubos de centrífuga	FroggaBio	1210-00S	Usado para centrifugar pequenos volumes
15 ml Tubos de centrífuga cônicos	Fisher	1495970C	Usado na cultura de células primárias
Inibidor de tripsina definido	Fisher	R007100	DTI
Ditiotreitol	Fisher	BP172-25	DTT
Meio de células epiteliais (kit completo)	ScienCell	4101	Inclui suplementos de soro e fator de crescimento)
Glicerol	Fisher	BP229-1	Componente do tampão de carregamento SDS-PAGE
100 mM Guanosina 5'-trifosfato, 1 ml	Jena Bioscience	272076-0251M	GTP
HCT116 carcinoma colorretal	ATCC	CCL-247	Linha celular de câncer humano
Células epiteliais tubulares proximais renais humanas	ATCC	PCS-400-010	HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose	GE Life Sciences	SH30022.01	Meio padrão para cultura de células humanas
Solução de Hyclone Penicilina-Estreptomicina	GE Life Sciences	SV30010	Componente antibiótico do DMEM
H35 HypOxystation	Hypoxygen	N/A	Estação de trabalho de hipóxia
Igepal CA-630	MP Biomedicals	2198596	Componente detergente do tampão de lise
Fosfato monopotássico	Fisher	P288-500	KH2PO4
Cloreto de potássio	Fisher	P217-500	KCl
Cloreto de magnésio	Fisher	M33-500	MgCl2
Cloreto de sódio	Fisher	BP358-10	NaCl
Fluoreto de sódio	Fisher	5299-100	NaF (componente inibidor da fosfatase do tampão de lise)
Fosfato dissódico	Fisher	5369-500	Na2HPO4
Grau Premium Fetal Bovino	Seradigm	1500-500	FBS
Coquetel de Inibidor de Protease (100x)	Sinalização Celular	58715	Componente do tampão de lise
Dodecil Sulfato de Sódio	Fisher	BP166-100	SDS
Ortovanadato de Sódio	Sigma	56508	Na3VO4
Tris Base	Fisher	BP152-5	Componente de tampões
0,05% Tripsina-EDTA (1x)	Life Technologies	2500-067	Tripsina usada para separar células aderentes