Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden
Summary
Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Abstract
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
Introduction
Translationele controle is in opkomst als een even belangrijke stap om gentranscriptieregulatie in genexpressie, vooral in perioden van cellulaire stress 1. Een brandpunt van de vertaling controle is op de snelheidsbeperkende stap van initiatie, waar de eerste stappen van de eiwitsynthese betrekking hebben op de binding van de eukaryote initiatie factor 4E (eIF4E) naar de 7-methylguanosine (m 7 GTP) 5 'cap van mRNA 2 . eIF4E maakt deel uit van een trimere complex genaamd eIF4F dat eIF4A, een RNA-helicase en eIF4G, een steiger eiwit nodig is voor de indienstneming van andere vertaling factoren en de 40S ribosoom 3 bevat. Onder normale fysiologische omstandigheden, de meeste mRNA vertaald door een cap-afhankelijk mechanisme, maar onder perioden van cellulaire stress ongeveer 10% van humane mRNAs bevatten 5 'UTR die cap-onafhankelijke translatie waardoor inwijding 1,4. Cap-afhankelijke vertaling is van oudsher synoniemlende met eIF4F echter, stress-specifieke variaties van eIF4F hebben een trending topic 5-8 geworden.
Verschillende cellulaire stress veroorzaken eIF4E activiteit die moet worden onderdrukt via de zoogdieren doelwit van rapamycine complex 1 (mTORC1). Dit kinase minder wordt onder stress, wat resulteert in de verhoogde activiteit van een van de doelstellingen, de 4E-bindend eiwit (4E-BP). Niet-gefosforyleerde 4E-BP bindt aan en blokkeert eIF4E zijn vermogen tot interactie met eIF4G waardoor de onderdrukking van cap-afhankelijke translatie 9,10. Interessant is dat een homoloog van genoemd eIF4E eIF4E2 (of 4EHP) een veel lagere affiniteit voor 4E-BP 11, waardoor het mogelijk stress gemedieerde repressie onttrekken. Inderdaad, aanvankelijk gekarakteriseerd als een repressor van translatie vanwege het gebrek aan interactie met eIF4G 12, eIF4E2 initieert de translatie van mRNAs die honderden RNA hypoxieresponselementen elementen in de 3 'UTR bevatten in hypoxische spanning 6,13. Deze activering is bereikt door interactie met eIF4G3, RNA bindend eiwit motief 4, en de hypoxia induceerbare factor (HIF) 2α een hypoxische eIF4F complex of eIF4F H 6,13 vormt. Als een repressor onder normale omstandigheden, eIF4E2 bindt met GIGYF2 en ZNF598 14. Deze complexen werden gedeeltelijk geïdentificeerd door middel van agarose-gekoppelde m 7 GTP affiniteitsharsen. Dit klassieke methode 15 is standaard op het gebied van vertaling en is de beste en meest gebruikte techniek om-cap bindende complexen te isoleren in pull-down en in vitro bindingstesten 16-19. Als de cap-afhankelijke translatie machinerie is in opkomst als flexibel en aanpasbaar met inter-wisselende delen 6-8,13, deze methode is een krachtig instrument om nieuwe-cap-bindende eiwitten die betrokken zijn bij de reactie op stress snel kan identificeren. Bovendien verschillen in eIF4F kan grote gevolgen hebben als een aantal eukaryote modelsystemen blijken een eIF4E2 homoloog voor stressreacties zoals gebruikenals A. thaliana 20, S. Pombe 21, D. melanogaster 22 pt 23 C. elegans.
Er zijn aanwijzingen dat variaties in eIF4F niet strikt kan beperkt stresssituaties, maar worden in normale fysiologie 24. De zuurstoftoevoer naar weefsels (at capillair uiteinden) of binnen weefsels (gemeten met micro-elektroden) varieert van 2-6% in de hersenen 25, 3-12% in de longen 26, 3,5-6% in de darm 27, 4% in de lever 28, 7-12% in de nier 29, 4% in de spieren 30 en 6-7% in het beenmerg 31. Cellen en mitochondriën bevatten minder dan 1,3% zuurstof 32. Deze waarden zijn veel dichter bij hypoxie dan de omgevingslucht wanneer cellen worden routinematig gekweekt. Dit suggereert dat wat eerder werd gezien als hypoxie-specifieke cellulaire processen betrokken in een fysiologische omgeving zijn. Interessant, eIF4F en eIF4F H </sup> actief deelnemen aan de translatie-initiatie van verschillende zwembaden of klassen van mRNA in verschillende menselijke cellijnen blootgesteld aan fysiologische zuurstof of "physioxia" 24. Lage zuurstof rijdt ook een goede ontwikkeling van de foetus 33 en cellen hebben in het algemeen een hogere proliferatie tarieven, langere levensduur, minder DNA-schade en minder algemene stressreacties in physioxia 34. Daarom eIF4F H is waarschijnlijk een belangrijke factor in de expressie van geselecteerde genen onder fysiologische omstandigheden.
Hier bieden we een protocol om kweekcellen in vaste fysiologische zuurstofarme omstandigheden of in een dynamisch fluctuerende bereik dat waarschijnlijk meer representatief is voor het weefsel micro-omgevingen. Een voordeel van deze methode is dat de cellen worden gelyseerd in de hypoxie werkstation. Het is vaak niet duidelijk hoe de overgang van hypoxische celkweek cellysis wordt uitgevoerd in andere protocollen. De cellen worden vaak eerst verwijderd uit een klein hypoxie incubator wordenvoorgrond lysis, maar deze blootstelling aan zuurstof kunnen beïnvloeden biochemische pathways de cellulaire reactie op zuurstof snel (één of twee min) 35. Bepaalde-cap-bindende eiwitten nodig interacties met een tweede base of kan de m 7 GTP, daarom enkele cap interactors kan worden gemist in het zuiveringsproces te hydrolyseren. -Agarose gebonden enzymatisch resistente cap analoga kunnen worden gesubstitueerd in dit protocol. Het verkennen van de activiteit en de samenstelling van eIF4F H en andere variaties van eIF4F door middel van de hier beschreven methode zal licht werpen op de ingewikkelde genexpressie machines dat cellen gebruiken tijdens fysiologische omstandigheden of stressreacties.
Protocol
Representative Results
Discussion
De analyse van cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan fysiologische zuurstofarme omstandigheden kunnen zorgen voor de identificatie van nieuwe zuurstof gereguleerde translatie initiatie factoren. De affiniteit van deze factoren de 5 'cap van mRNA of andere cap geassocieerde eiwitten kunnen worden gemeten door de kracht van hun associatie met m 7 GTP-gekoppelde agarose parels. Een nadeel van deze techniek is dat het meet de dop bindende eiwitten potentieel van post-lysis, maar het word…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
Referências
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
- Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
- Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
- Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
- Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
- Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
- Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
- Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
- Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
- Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Bioquímica. 23 (2), 177-181 (1984).
- Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
- Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
- Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
- Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
- Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
- Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
- Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5′-3′ mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
- Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
- Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
- Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
- Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
- Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
- Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
- Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
- Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
- Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394 (2002).
- Gleadle, J., Ratcliffe, P. . Hypoxia. , (2001).
- Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
- Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
- Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
- Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
- Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
- Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
- Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs–a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
- Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).
