생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석
Summary
Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Abstract
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
Introduction
번역 컨트롤은 특히 세포 스트레스 일의 기간 동안, 유전자 발현의 전사 조절에 동등하게 중요한 단계로 부상하고있다. 번역 제어의 초점은 단백질 합성의 첫 번째 단계는 7 methylguanosine에 진핵 개시 인자 4E (eIF4E에)의 결합을 포함 개시의 속도 제한 단계 (m 7 GTP)의 mRNA 2의 5 '캡에있다 . 의 eIF4E는 eIF4A, RNA 헬리 카제 및 eIF4G, 다른 번역 요인과 40S는 3 리보솜의 채용에 필요한 비계 단백질을 포함 eIF4F라는 이름의 삼량 체 복합체의 일부입니다. 정상적인 생리 조건에서의 mRNA의 대부분은 모자에 의존하는 메커니즘을 통해 번역되어 있지만, 세포 스트레스의 기간에 따라 인간의 mRNA의 약 10 %는 1,4 intiation 모자 독립적 인 번역을 허용 할 수있는 5 '의 UTRs가 포함되어 있습니다. 모자 종속 번역은 역사적으로 동의어있다OU에 eIF4F으로, 그러나, eIF4F의 스트레스 별 변화는 추세 주제 5-8이되었다.
다양한 세포 응력의 eIF4E 활성이 라파 마이신 복합체 1 (mTORC1)의 포유 동물 표적을 통해 억압되도록. 이러한 키나아제의 목표 중 하나의 증가 된 활성을 초래 응력 하에서 손상되고, 제 (4E-BP) 단백질 4E는 바인딩. 비 인산화 4E-BP는의 eIF4E 및 블록 eIF4G 모자 종속 번역 9,10의 억압의 원인과 상호 작용하는 능력을 결합한다. 흥미롭게도, eIF4E2 (또는 4EHP)라는 이름의 eIF4E의 동족체는 아마도 스트레스 중재 억압을 회피 할 수 4E-BP (11)에 대한 훨씬 낮은 친 화성을 가지고있다. 사실, 처음으로 인해 eIF4G (12)과의 상호 작용의 부족에 번역의 리프레 특징, eIF4E2는 저산소 스트레스 6,13- 동안 그들의 3 'UTR에서 RNA 저산소증 응답 요소를 포함 mRNA를 수백의 번역을 시작합니다. 이 활성화 난eIF4G3, RNA는 저산소 eIF4F 복합체, 또는 eIF4F H 6,13-을 구성하는 단백질 모티브 (4) 및 저산소증 유도 인자 (HIF) 2α 바인딩과의 상호 작용을 통해 달성 s의. 정상적인 조건에서 리프레으로 eIF4E2는 GIGYF2 및 ZNF598 (14)와 결합한다. 이 단지는 부분적으로 아가로 오스 연계 m 7 GTP 친 화성 수지를 통해 확인되었다. 이 고전적인 방법 (15)는 번역의 분야에서 표준과 최고의 가장 일반적으로 아래로 끌어 오기에 캡 결합 복합체를 분리하는 기술을 사용하고 체외에서 결합 분석 16-19입니다. 캡 – 의존적 번역 기계가 상호 변경 부 6-8,13와 같이 유연하고 적응력이 대두되고,이 방법은 급속 스트레스 반응에 관여하는 신규 한 캡 – 결합 단백질을 확인하기위한 강력한 도구이다. 여러 진핵 모델 시스템은 스트레스 반응 등을위한 eIF4E2의 동족체를 사용하여 나타나는 또한, eIF4F의 변화는 광범위한 영향을 미칠 수A. 장대 (20)로, S. Pombe 21 D. 22을 melanogaster의, 그리고 C. 23 엘레 간스.
증거 eIF4F 변동 엄격 조건을 강조하지만, 정상적인 생리 24에 관여 한정되지 않을 수 있음을 시사한다. (미소 전극을 통해 측정) (모세관 말단) 또는 조직 내에서 조직으로의 산소 공급은 뇌 25 2-6 %에서 다양 폐 26 3-12 %, 27 장, 4 %에서 3.5-6 %의 간 28 신장 29 7~12% 근육 30 4 %, 골수 31 6~7%. 세포와 미토콘드리아는 1.3 % 산소 32 이하를 포함한다. 이 값은 세포가 일상적으로 배양 주변 공기보다 저산소증에 훨씬 가깝다. 이것은 무엇을하는 것은 이전에 저산소증 특정 세포 과정은 생리 학적 환경에서 관련 될 수있는 것으로 생각하고 있음을 시사한다. 흥미롭게도, eIF4F 및 eIF4F H </suP> 적극적으로 생리 학적 산소 또는 "physioxia"(24)에 노출 된 여러 가지 인간의 세포 라인에 독특한 풀 또는의 mRNA의 클래스의 번역 개시에 참여한다. 낮은 산소는 적절한 태아의 개발 (33)를 구동 세포는 일반적으로 높은 확산 속도, 긴 수명, 적은 DNA 손상과 physioxia (34) 덜 일반적인 스트레스 반응이 있습니다. 따라서, eIF4F H 가능성이 생리 학적 조건에서 선택 유전자의 발현에 중요한 요소이다.
여기, 우리는 고정 된 생리 학적 산소 조건에서 또는 조직의 미세 환경의 가능성이보다 잘 나타내는 동적 변동 범위 내에서 배양 세포에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 장점은 세포가 저산소 워크 스테이션 내에 용해된다는 것이다. 이 세포 용해에 저산소 세포 배양에서 전환 다른 프로토콜에서 수행되는 빈도를 명확하지 않다. 세포는 종종 첫 번째 작은 저산소증 인큐베이터에서 제거 할 수산소의 세포 응답 (하나 또는 두 개의 분) 35 빠른 같이 앞 용해,하지만 산소이 노출 생화학 적 경로에 영향을 미칠 수 있습니다. 특정 캡 – 결합 단백질은 제 2베이스와의 상호 작용을 필요로하거나, 따라서 일부 캡 인터랙는 정제 과정에서 누락 될 수 m 7 GTP를 가수 분해 할 수있다. 아가 로스 결합 된 효소 방수 캡 유사체로는이 프로토콜에서 치환 될 수있다. 여기에 설명 된 방법을 통해 활동과 eIF4F H 및 eIF4F의 다른 변형의 구성을 탐색하는 세포 생리 학적 조건 또는 스트레스 반응시 활용 복잡한 유전자 발현 기계에 빛을 흘릴 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포 캡 결합 단백질의 분석은 신규 산소 조절 번역 개시 인자의 확인을 허용 할 수있다. mRNA의 캡 또는 다른 관련 단백질의 5 '캡 이러한 요소의 선호도가 7 m 그들의 관계의 강도에 의해 측정 될 수 아가 로스 비드 GTP 결합. 이 기술의 한 가지주의는 단백질 분해 이후의 캡 결합 전위를 측정하지만,이 단백질 – 단백질 상호 작용과 번역 후 변형 (PTMS)을 유지…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
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